裂谷熱假病毒顆粒研制及鑒定

鄧俊花 林祥梅 張永寧 馮春燕 王彩霞 吳紹強

裂谷熱（Rift valley fever，RVF）是由蚊子作為傳染媒介的病毒性傳染病，主要感染反芻動物，如綿羊、山羊和牛，可引起懷孕動物流產和幼小動物死亡［1］。在疫病流行期間，也會引起人類發病。世界動物衛生組織（OIE）將其列為法定上報的A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。歷史上，裂谷熱主要在非洲撒哈拉以南地區流行，2000年8月向北蔓延到亞洲的阿拉伯半島（也門和沙特阿拉伯），對我國構成了嚴重威脅［2］。

為了有效監控并防止裂谷熱疫情的傳播，Sall等［3，4］建立了裂谷熱的巢式RT-PCR檢測方法，并在肯尼亞（1998年）及南非（1999年）的兩次疫情診斷中發揮了重大作用。Drosten等［5，6］建立了裂谷熱一步法實時定量RT-PCR檢測方法。但由于安全有效陽性質控物質的缺乏，導致上述檢測技術難以在非疫區推廣應用。近幾年，Pasloske等［7，8］提出了一種新的RNA質控品制備技術，即裝甲RNA（Armored RNA）技術，利用該技術制備的假病毒顆粒穩定、安全，并能有效監控RNA樣品核酸制備及RT-PCR反應的全過程。病毒樣顆粒（Virus like particle，VLP）是含有某種病毒的一個或多個結構蛋白的空心顆粒，不含病毒核酸，不能自主復制，但可以組裝成顆粒樣結構，其結構和抗原表位與天然的病毒顆粒十分相似，具有較強的免疫原性及較好的安全性。在體外通過特殊方法將病毒樣顆粒與重組質粒DNA（如基因疫苗）融合，轉錄成的重組RNA包入病毒樣顆粒內，即形成假病毒（pseudovirus）。

RVFV屬布尼亞病毒科白嶺病毒屬（phlebovinzs）RNA病毒，具包膜，核酸共分L、M和S 3個節段，L節段編碼RNA多聚酶，M節段編碼病毒包膜蛋白，均為負鏈RNA。S節段編碼核蛋白和非結構蛋白，部分為負鏈，其他部分為正鏈，即呈所謂雙義（ambisense）結構。補體結合反應抗原同部分S節段編碼的N蛋白相關。

本研究針對裂谷熱病毒中比較保守的S基因設計引物和探針，研制裂谷熱假病毒顆粒，并進一步借助熒光RT-PCR方法進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

MS2-T質粒，是包含MS2第12-1796位的T載體重組質粒，由華大吉比愛生物技術有限公司陳唯軍教授惠贈。pGEM-T-RVF質粒，是包含RVFV S基因第12-576位的T載體重組質粒，由本實驗室構建、保存。pTrcHis2A載體購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank上裂谷熱病毒S基因序列（GenBank登錄號DQ380149）設計了熒光RT-PCR引物rvfv-u1/L1和探針rvfv-p1［9］，同時設計了2套PCR引物RVF-F/R（分別引入酶切位點Pst I和Hind Ⅲ）和Vector-F/R。引物序列見表1。

表1 所用基因的引物及探針序列

1.2.2 p-MS2假病毒載體構建 MS2-T質粒和表達載體pTrcHis2A分別進行Nco I和Bgl II雙酶切，酶切體系為 ：Nco I/Bgl II 1μL，10×K buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，模板 1μg，補水至 20μL，37℃ 2h。酶切產物分別命名為pTrcHis2A（N/B）和MS2-T（N/B）。分別將酶切產物進行膠回收純化，用T4 DNA連接酶連接，連接體系為：10× buffer 1μL，T4 酶 5 U，pTrcHis2A（N/B）50ng，MS2-T（N/B）150ng，25℃，10min，然后立即放冰上。將連接產物進行轉化，挑取單克隆搖菌，以Vector-F/R為引物對菌液進行PCR鑒定。將PCR鑒定為陽性的克隆抽提質粒，送北京諾賽基因組研究中心測序。測序正確的菌株命名為p-MS2，于-86℃保存備用。

1.2.3 p-MS2-RVF重組質粒構建 pGEM-T-RVF質粒與p-MS2質粒分別進行Pst I和Hind Ⅲ雙酶切。將酶切產物回收純化，用T4 DNA連接酶連接。連接產物轉化，分別以RVF-F/R、Vector-F/R為引物進行PCR鑒定，測序。測序正確菌株命名為p-MS2-RVF，于-86℃保存備用。

1.2.4 p-MS2-RVF假病毒顆粒純化及特性鑒定

1.2.4.1 假病毒顆粒的表達與初步純化 p-MS2-RVF重組菌加入1mmol/L的IPTG誘導表達16h，離心，菌體沉淀用1×TE buffer混勻，按1 1000加入溶菌酶（25mg/mL），37℃裂解處理30min，4℃，12000r/min離心15min，上清即為含假病毒顆粒的表達產物。按表達產物∶酶量=125 1 1分別加入RNaseA（1mg/mL）和DNase I（1mg/mL）37℃消化1h。消化產物依次經過鹽沉淀、氯仿作用后，得到粗純的假病毒顆粒溶液。參照文獻［10］。

1.2.4.2 假病毒顆粒的純化 在超速離心管中制備蔗糖密度梯度溶液，加入含假病毒顆粒的溶液，最后 用 SM（0.1mol/L NaCl，8mmol/L MgSO4·7H2O，50mmol/L Tris-Cl pH7.5，2％明膠溶液）溶液補滿。分級梯度于4℃，40000r/min，離心12h。回收含假病毒顆粒的區域，再超速離心，去上清，加入適量SM溶液，重懸沉淀，進行PCR與RT-PCR鑒定純化效果。

1.2.5 假病毒顆粒特性鑒定 敏感性試驗：將50μL/管純化的假病毒顆粒溶液分別放置于56℃（1d）、37℃（20d）、 常溫（30d）、 4℃（30d）、 -20℃（60 d），每種條件下5份樣本，每份樣本各取10μL混勻，進行樣品處理后RT-PCR鑒定。RNase A攻擊試驗：在50μL假病毒顆粒溶液中分別加入RNase A（1mg/mL）1-4μL后，37℃放置 30min，對照組不加RNase A，每種條件下5份樣本，每份樣本各取10μL混勻，RNA抽提后進行RT-PCR鑒定。電鏡觀察：純化的假病毒顆粒溶液經1％醋酸雙氧鈾負染后，利用透射電鏡（JEM-1400）進行形態鑒定。

1.2.6 裂谷熱假病毒顆粒熒光RT-PCR方法鑒定

將裂谷熱假病毒顆粒溶液進行10倍系列稀釋，采用Trizol（Invitrogen，USA）試劑分別提取RNA，對應4.25×108-4.25×102copies/mL，裂谷熱熒光RT-PCR檢測體系如下：10×PCR Buffer（Mg2+）2.5μL，MgCl2（2.5mmol/L）5.0μL，d NTP（各 2.5mmol/L）2.5μL，rTaq DNA Polymerase 2.5 U，AMV-XL 2.5 U，RNase Inhibitor 20 U，Rvfv-u1/L1（10μmol/L）10 pmol/10 pmol，Rvfv-p1（10μmol/L）10 pmol， 模 板 RNA 10ng。RT-PCR反應程序：50℃反轉錄30min；94℃預變性5min；94℃變性30s，47℃退火30s，擴增40個循環，每個循環反應結束時收集熒光信號。

2 結果

2.1 p-MS2質粒測序結果

p-MS2質粒經測序，MS2目的片段完全正確插入載體pTrcHis2A中。

2.2 p-MS2-RVF菌液PCR鑒定及測序結果

以p-MS2-RVF菌液為模板，分別以RVF-F/R，Vector-F/R為引物進行PCR鑒定。PCR產物經1％瓊脂糖電泳（圖1）顯示，目的條帶分別在500-700bp、2000-3000bp之間，與預設計的目的基因片段大小（584bp和2 479bp）相符。經測序RVFV目的片段已正確插入至載體p-MS2中。

2.3 假病毒顆粒純化效果鑒定

純化產物作為RT-PCR反應模板，其中一組不經過反轉錄直接進行PCR鑒定，檢測結果為陰性，表明制備的假病毒顆粒溶液中無DNA污染。另一組樣本進行RT-PCR鑒定，檢測結果呈陽性，表明裂谷熱基因片段已經重組于假病毒顆粒中，而且模板以RNA形式存在（圖2）。

圖1 裂谷熱p-MS2-RVF菌液PCR鑒定

圖2 假病毒顆粒純化效果

2.4 純化后的假病毒顆粒溫度敏感試驗

經試驗，假病毒顆粒溶液在37℃情況下至少可以保存20d，隨著保存溫度降低，保存時間越長。由此可以看出，該假病毒顆粒具有良好的穩定性（圖 3）。

圖3 假病毒顆粒溫度敏感性檢測結果

2.5 穩定性試驗（RNase A攻擊試驗）

用RNaseA處理的假病毒顆粒溶液與對照組樣品分別進行RT-PCR鑒定，檢測結果一致，表明制備的假病毒顆粒溶液可抵抗RNaseA的降解（圖4）。

2.6 電鏡觀察

超聲破碎表達產物經SYBR Green染色后通過蔗糖密度梯度離心，可以看到在密度為35％區域內有綠色熒光條帶出現。利用透射電鏡對假病毒顆粒純化樣品進行觀察圖5，可以看到直徑大約為26nm的多邊形顆粒，即誘導表達的假病毒顆粒。

圖4 假病毒顆粒穩定性檢測結果

圖5 假病毒顆粒的電鏡觀察結果

2.7 假病毒顆粒熒光RT-PCR鑒定及其敏感性檢測

如圖6所示，隨著稀釋倍數的增加，Ct值逐漸增加。經多次試驗表明，本方法對裂谷熱假病毒顆粒溶液最低檢測可達4.25×102copies。

圖6 不同稀釋濃度假病毒顆粒溶液與熒光信號Ct值關系圖

3 討論

早期MS2噬菌體的研究發現，在復制酶5'端存在一個由19個堿基組成的莖環結構（發夾結構），堿基序列為5'-ACAUGAGGAUUACCCAUGU-3'，是包膜蛋白二聚體與RNA相互作用的部位，這種相互作用形成的復合物是噬菌體自我包裝的信號，在復合物的基礎上，成熟酶蛋白與其他包膜蛋白分子結合并在自由能的驅動下形成相應的空間構象，完成MS2噬菌體的組裝［8，11-17］。本研究在該結構相應的基因序列下游插入了外源基因RVFV的S基因片段，借助載體上的轉錄啟動子和終止子進行基因調節，表達產物經過菌裂解，雙酶（DNase I和RNase A）消化，梯度離心等處理，獲得含有RVFV外源基因的假病毒顆粒。

研究表明沒有成熟酶蛋白的VLPs，其內包裝的 RNA 易被 RNase降解［18，19］。另外，在成熟酶蛋白的基因上存在一個與包裝位點相似的一致性序列［20］，有研究［21］認為這個類包裝位點的存在使MS2的包膜蛋白在包裝時出現了協同效應，這種協同效應可以使RNA在低濃度的時候就可以引起包裝，增加了包裝的效率。另外，成熟酶蛋白有兩個位點與RNA相互作用［22］，這使得MS2包膜蛋白的包裝更容易進行。本研究通過對制備的假病毒顆粒先后進行溫度敏感試驗、RNase A攻擊試驗數據表明，此假病毒顆粒具有耐RNase的特性，穩定性良好，在室溫可以保存至少30d，4℃可以保存更長時間，從而解決了RNA質控品使用、保存和運輸的穩定性問題。

在大腸桿菌中表達的假病毒顆粒主要存在于裂解物的上清中，由于在裂解過程中，大量復制的質粒DNA也同樣隨病毒樣顆粒進入上清中，如果加入DNase I的比例不當，很難將質粒DNA完全降解。本研究通過摸索，優化表達產物和酶加入的比例，純化的假病毒顆粒溶液先進行純度鑒定，提取的RNA直接進行PCR鑒定，呈陰性，表明此溶液中無DNA污染；另一組RNA先反轉錄再進行PCR鑒定，呈陽性，則表明此病毒顆粒中包含有RVFV外源基因。進一步以假病毒顆粒提取的RNA為材料，進行熒光Real-time RT-PCR方法鑒定，該方法中裂谷熱假病毒顆粒溶液最低檢測限可達4.25×102copies。

4 結論

在國內外首次構建了包裹裂谷熱病毒S基因片段 RNA的假病毒顆粒，穩定性良好，具有耐RNase的特性，安全無污染，易運輸。研制的裂谷熱假病毒顆粒，憑借熒光RT-PCR方法最低可達到4.25×102copies檢測限，可作為參比物質應用于裂谷熱臨床分子生物學檢測方法。

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