動力學模型在熒光定量PCR數據處理中的優勢

劉彥禮 李旭 蘇振成 徐明愷 張惠文

自1993年第一次出現有關熒光定量PCR技術的記錄，1996年ABI（Applied Biosystems）公司使熒光定量PCR（real-time fluomgenetic quantitative PCR，FQ-PCR）技術商業化，并制造出第一臺熒光定量PCR儀，迄今因該技術較以往核酸定量研究方法，如Nothern blotting、RNase-protection、Semiquantitative RT-PCR等，具有靈敏度高、特異性和可靠性好、自動化程度高、具實時性和準確性等特點，所以目前廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域［1-4］。實時熒光定量PCR是在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術。它是通過在PCR反應體系中加入熒光基團（探針類和染料類），利用每個循環末對熒光信號積累的捕捉來實時監測整個PCR進程，從而建立起熒光量與初始模板量的對應關系，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法［5］。對于熒光定量PCR數據分析方法包括絕對定量和相對定量兩種。前者是應用精確定量的標準品，構建標準曲線，以此來定量未知樣品中初始基因拷貝數。雖然該方法能夠直接得到目的基因的拷貝數，且具有穩定、直觀等優點，但是其數據可靠的前提是得到精確定量的標準品，鑒于目前核酸定量技術的不足，標準品的制備無統一標準，所以數據缺乏可比性；而且標準品與試驗樣品擴增效率的差異也影響了該方法應用；再者絕對定量也不適合高通量的定量分析。而相對定量在一定程度上彌補了絕對定量的不足，其是指在測定目的基因的同時測定一內源性穩定表達內參基因，通過比較處理前后的目的基因相對于內參基因歸一化的比值，來衡量目的基因在處理前后的表達差異，并不需要確定目的基因具體的拷貝數。盡管相對定量存在著一定的缺點，但其仍是目前處理熒光定量數據的主流方法，尤其是定量mRNA拷貝數［6］。本試驗在用上述3種方法就行處理數據的過程中，假定未稀釋樣品為對照（control），不同的稀釋梯度的樣品為處理（sample），理論上目的基因IL-10的變化率為1。最終通過比較不同方法計算的結果與理論值的差異進行分析，旨在探討動力學模型在定量結果的可靠性、方便性及經費節約方面的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 Taq DNA 聚合酶、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）購自大連寶生物工程有限公司；ABI 7000型實時熒光定量 PCR擴增儀為美國ABI公司生產；Univeral Hood SN-75S型紫外凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司生產。

1.1.2 試驗樣品 本試驗所應用的內參基因（β-actin）與目的基因（IL-10）的cDNA由本課題組通過反轉錄得到，并對得到的cDNA進行5倍的梯度稀釋。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR反應條件確定 利用體外轉錄生成的 cDNA 作為模板，從多次重復性試驗中發現，該檢測方法最適反應總體積25μL，其中模板1μL；最適的引物濃度為0.4μmol/L，其余組分濃度依據試劑盒使用說明。最適循環參數為：95℃ 30；之后 95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 31s，40 個循環 ；最終72℃ 5min。PCR反應完成后以60℃為起點做產物的熔解曲線。β-actin特異性引物（F：5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'，R：5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'）與IL-10的特異性引物（F：5'-ACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCA-3'，R ：5'-CTATGCAGTTGATGAAGATGTCAAA-3'），擴增片段大小分別為348bp和237bp［7］，由華大基因合成。

1.2.2 相對定量方法

1.2.2.12－△△Ct法 該方法是傳統的處理熒光定量數據的方法，其通過假設目標基因與內參基因擴增效率相等且均為100％，即Etarget=Eref= 1［8］，這樣大大簡化了試驗數據的處理過程，其數學模型基于PCR指數擴增的公式：

Xn= X0×（1+ E）n

其中Xn是循環數為n時基因的拷貝數，X0為初始基因拷貝數，E為基因的擴增效率，Ct代表目標擴增產物達到設定閾值所經歷的循環數，因此

XCt-target= X0-target×（1+ Etarget）Ct-target=Ktarget

其中XCt-target為目標基因達到設定閾值時的拷貝數，X0-target為目標基因初始拷貝數，Ct-target為目標基因擴增到設定閾值時的循環數，對于目標基因和內參基因來說，達到閾值時其基因拷貝數固定，所以Ktarget為常數，同理：

其中X0-target/X0-ref代表經過內參基因歸一化處理的初始目標基因拷貝數的比值，用S表示；△Ct表示目標基因和內參基因Ct值的差異，△Ct = Cttarget － Ct-ref；Ktarget/Kref為一常數，設為K，對公式進行變形得：

S = K × 2－△Ct

因此用處理后樣品的Ssample除以處理前樣品的Scontrol得到：

公式中的－△△Ct = △Ctsample－△Ctcontrol

1.2.2.2 雙標準曲線法 該方法應用上述準備好的梯度稀釋cDNA分別做出目的基因與管家基因的標準曲線，然后從各自的標準曲線上求出初始模板量，經管家基因歸一化處理后，求出目的基因的相對含量［9，10］。其也基于PCR指數擴增的公式：

Xn= X0×（1 + E）n

其中Xn是循環數為n時基因的拷貝數，X0為初始基因拷貝數，E為基因的擴增效率，當熒光值達到閾值時其數學公式表示如下：

XCt= X0×（1 + E）Ct

兩邊同時取對數：log XCt= Ct×log（1 + E）+ log X0，變形得：

Ct = － log X0/log（1+E）＋ log XCt/log（1+ E）

由于達到閾值時，XCt和E為常數，所以設

a = － 1/log（1 + E）；b = log XCt/log（1 + E）

則公式轉化為線性方程：

Ct = a×log X0＋ b

由此構建出基因初始拷貝數與Ct的線性關系。從而通過求出未知樣本內目標基因的Ct值即可求出目標基因的相對初始拷貝數。通過上述模型，我們進行目標基因的相對定量：

由以上公式可以求出X（target-control）（處理前樣品中目標基因的相對初始拷貝數）、X（ref-control）、X（target-sample）和X（ref-sample），歸一化處理表示目的基因在處理前后的表達差異率Ratio為：

Ratio =［X（target-sample）/X（ref-sample）］/［X（target-control）/X（ref-control）］

將 a = － 1 /log（1 + E）；b = log XCt/log（1 + E）帶入公式后，整理得：

Ratio =（1+Etarget）△Ct（control-sample）/（1+Eref）△Ct（control-sample）

若假設上述公式Etarget=Eref= 1，則ratio =2－△△Ct，其中－△△ Ct = △ Cttarget－△ Ctref，因此可以將2－△△Ct法作為雙標準曲線法的一個特例。

1.2.2.3 基于動力學的相對定量方法 通過上述兩種計算方法的比較，可以明確基因的擴增效率對后期數據處理的影響，并且這種影響通過指數形式進行放大。上述兩種計算方法假定PCR反應在指數擴增期時效率相等，但實際情況卻是在制備樣品cDNA的過程中，已經將不同濃度的鹽、酚、氯仿、乙醇等帶入到樣品中，這些有毒物質將不同程度的抑制酶的活性，使實際的擴增效率低于理想值；并且在樣品的梯度稀釋過程中，這些有毒物質也被稀釋，

因此減少了對酶的抑制，這就造成了梯度稀釋樣品本身的擴增效率就不一致，從而使通過雙標準曲線法得到的值與真實值有差異［11］。針對這種情況，近年來許多文獻［12-16］提出通過模擬熒光定量PCR儀所給出的樣品擴增曲線建立熒光量與Ct值之間的直線或曲線，以此來獲得反應的擴增效率或基因初始拷貝數，并且設計出一系列方便試驗人員進行試驗的模型和軟件。該模型假定在單一PCR擴增反應的指數期內期擴增效率恒定，建立熒光量的對數值與Ct值之間的線性關系，從而獲得反應擴增效率，經管家基因歸一化處理后得到目的基因在處理前后的表達差異。其模型與雙標準曲線法相似，但不是通過對樣品梯度稀釋獲得標準曲線間接獲得擴增效率，而是利用每個梯度樣品的真實擴增曲線來獲得我們需要的熒光量和與之對應的Ct值，從而直接得出該梯度PCR反應的擴增效率。Ramakers等［8］在此基礎上設計出軟件LinRegPCR以為廣大研究者提供方便。由假設可知：

Fn= F0×（1 + E）n

其中Fn是循環數為n時基因擴增產物的熒光量，F0為初始基因的熒光量，E為基因的擴增效率。當熒光值達到閾值時數學公式表示如下：

FCt= F0×（1 + E）Ct

兩邊同時取對數：log FCt= Ct×log（1 + E）+log F0變形得：Ct = log FCt/log（1 + E）－log F0/log（1 + E）

因為是單一反應模板量恒定，所以log F0為一常數，且E值恒定。

若設 a = 1/log（1 + E）；b = log F0/log（1 + E），則公式簡化為：

Ct = a × log FCt－ b

當在擴增的指數期，通過取一系列的熒光值以及與之對應的Ct值，線性擬合求出E值后，帶入公式：Ratio =（1+Etarget）△ Ct（control-sample）/（1+Eref）△ Ct（control-sample）

通過Ratio值反應出目的基因在處理前后的表達差異。

2 結果

2.1 熒光定量PCR操作特異性與重復性檢驗

試驗通過熒光定量PCR給出的熔解鏈曲線（圖1），并輔助以瓊脂糖凝膠電泳驗證該方法的特異性（圖2），從圖1中熔解鏈曲線只有單一的峰以及圖2中瓊脂糖凝膠電泳跑出的單一條帶，這些都很好的說明了所采用引物的高特異性；同時通過對同一樣品在3個時間點，每個時間點上做3個重復以驗證方法的可重復性和穩定性，通過特異性和重復性檢驗很好地保障了試驗數據的可靠性。

圖1 β-actin和IL-10熔解鏈曲線

圖2 熒光定量PCR儀擴增結果

2.2 梯度稀釋樣品熒光定量結果

對于樣品cDNA進行5倍梯度稀釋后，每個梯度3個重復，測得相應β-actin和IL-10的平均Ct值如表1所示。

2.3 三種相對定量方法結果

2.3.12－△△Ct法定量結果 由表3數據通過2－△△Ct方法計算出目的基因IL-10通過內參基因β-actin歸一化處理后變化率如表2所示。

2.3.2 雙標準曲線法定量結果 由表3數據構建β-actin和IL-10的標準曲線（圖3），利用線性擬合得到的斜率計算出Eβ-actin=0.5959，EIL-10=0.6886；通過前述公式計算出目的基因IL-10經內參基因β-actin歸一化處理后變化率如表3所示。

2.3.3 基于動力學的相對定量方法結果 根據動力學相對定量方法原理，在β-actin和IL-10擴增曲線的直線部分（圖4-a）隨機采集5個點，獲得與之對應的熒光量與Ct值，線性擬合得到相應的擴增效率（圖4-b），通過相應公式得出目的基因IL-10經內參基因β-actin歸一化處理后變化（表4）。

表1 熒光定量5倍梯度稀釋后樣品的數據

表2 2－△△Ct法定量結果

表3 雙標準曲線法定量結果

3 討論

3種模型處理數據的結果見表5。理論上同一樣品梯度稀釋后，其作為樣品的各個梯度中目的基因經表達差異率（Ratio）和經內參基因歸一化處理后相對于對照應為常數1。相同的原始數據通過3種模型處理后的定量結果與理論值比較，從均值、方差以及變異系數方面都說明動力學方法要優于雙標準曲線法和2－△△Ct法。動力學方法與雙標準曲線法計算出內參基因與目的基因的擴增效率均小于1，這與實際PCR過程的動力學相符，也直接說明了2-△△Ct法本身的前提條件就存在著不足，而且動力學方法所計算得到的每個梯度擴增效率隨著稀釋梯度的增加也隨之增加，進一步證明了模板制備中存在的有毒物質在PCR反應過程中對酶活性的影響。

圖3 β-actin和IL-10的標準曲線

圖4 β-actin和IL-10的擴增曲線及直線部分線性擬合

表4 動力學方法定量結果

表 5 三種數學模型處理結果的比較

但因2－△△Ct法對假設的簡化使得該方法只需一個變量（Ct值），即可快速獲得結果；同時，目的基因表達差異率越大該方法的可靠性就越高，故現在仍被廣泛使用；雙標準曲線法通過構建標準曲線獲得內參基因與目的基因的擴增效率，然而標準品稀釋的同時也稀釋了抑制PCR反應的有毒物質，使由該方法得到的擴增效率與真實值有一定誤差，并且通過這種方法所構建的標準曲線消耗了更多的定量試劑，增加了試驗成本，所以現在應用較少。隨著熒光定量上游技術的突破，試驗所得原始數據的可靠性越來越高，而動力學模型因以實時定量曲線為基礎通過線性擬合計算得到每一個基因的擴增效率，所以通過模型有效的屏蔽了PCR反應過程中潛在的影響因素，計算所得擴增效率的可靠性也隨之越來越高；同時因省去標準曲線來計算擴增效率，減少了試劑的消耗，降低了試驗成本，節省了有限的模板；而且針對動力學模型使用過程中遇到的線性擬合的問題，已經開發出多款供研究者利用的軟件，如LinRegPCR。

4 結論

在熒光定量PCR相對定量的數據處理過程中，通過實例對3種處理數據模型的精確性進行比較，發現動力學模型＞雙標準曲線法＞2－△△Ct法；此外應用動力學模型在節約試驗成本以及模板等方面的優勢也使其成為熒光定量研究領域中的一個熱點，圍繞其開發的多款軟件也表明該模型具有很大的發展前景。

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