一種新型海洋生物活性物質逆轉K562/A02細胞多藥耐藥的研究

張玉霞 梁瓊 雍國新

近幾年來學者們發現，在癌癥治療過程中導致治療失敗的主要原因是藥物耐藥和轉移，因此對這2個表型之間的關聯展開了廣泛的研究［1］。自20世紀80年代初Tsurno等報道鈣離子拮抗劑維拉帕米（Verapamil，異博定）能增強化療藥物對耐藥細胞的毒性以來，科學家對逆轉藥開展了廣泛深入的研究，其中對30多種不同的P-gp抑制劑做了150多個臨床試驗，沒有一種P-gp抑制劑被美國FDA批準，這些P-gp抑制劑主要缺點是毒副作用大，溶解度差、并且改變化療藥物的藥代動力學特征［2］，難以推廣應用。因而篩選毒副作用小、逆轉作用強的逆轉藥物就成為該領域的熱點研究之一。

海洋生物活性物質是抗腫瘤藥物研究中一個重要的研究領域。近十多年來，已從不同的海洋生物中分離到許多新型的抗腫瘤天然藥物，發現其可通過抑制細胞的增殖分裂或誘導細胞凋亡的機制發揮抗腫瘤的作用。目前已有十幾種抗腫瘤療效高、毒性低的海洋生物天然藥物或其結構改造化合物進入臨床試驗，顯現出誘人的前景［3］。FAT是本實驗室首次從我國南海海域生長的一種生物組織中分離出來的抗癌活性成分，具有較強的生物活性。本試驗中選取典型多藥耐藥細胞株K562/A02作為研究對象。通過探討FAT對K562/A02細胞的多藥耐藥逆轉作用及其逆轉機制，為其進一步研究和臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 K562細胞由中國科學院上海細胞生物學研究所提供，K562/A02細胞由中國醫學科學院天津血液研究所提供。

1.1.2 試劑和藥物 RPMI-1640粉（美國HyClone公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司產品）；ADM（阿霉素）、VRP（美國Alexis產品）；MTT、DMSO、SDS（美國Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA）（BM公司，北京鼎國生物技術有限公司分裝）；Folin-酚試劑（北京鼎國生物技術有限公司）；其它試劑（國產分析純）。

1.1.3 主要儀器 TC2323CO2培養箱（美國Shellab公司）；CH2-TKC-3倒置光學顯微鏡、CH3ORF200生物顯微鏡（日本Olympus Optical公司）；CJT-12超凈工作臺（北京昌平長城空氣凈化公司）；DG-5031型酶聯免疫檢測儀（國營華東電子管廠）；UV-1601紫外分光光度儀（日本Shimadzu公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；420A型pH計（美國ORION公司）；ZW-A型微量振蕩器（常州國華電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 四唑鹽（MTT）法藥物敏感性試驗

1.2.1.1 測定K562/A02細胞對ADM的耐藥倍數參照周建軍等［4］的改良MTT法，取細胞形態良好、對數生長期的K562細胞和K562/A02細胞分別經600r/min離心；5min，吸去上清，用含10％小牛血清的RPMI 1640培養基調整細胞數為1.1×108個/L，接種于 96孔 培養板，每孔 90μL（1×104cells），同時每孔加入不同濃度的阿霉素10μL，使其在K562細胞終濃度為：0、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0μmol/L，在K562/A02細胞的終濃度為：0、2.5、5.0、10.0、20.0 和 40.0μmol/L， 每 孔 終 體 積 為 100μL，每個濃度4個平行孔，其中阿霉素終濃度為0μmol/L的組為對照組，另外設調零孔（只加RPMI 1640培養液100μL，不加細胞和藥物），混勻后置37℃、5％CO2培養箱中培養48h；在每孔中加入5mg/mL的MTT磷酸鹽緩沖液20μL終止反應，在同樣條件下繼續培養4-6h；每孔加入100μL三聯液過夜，使形成的甲瓚顆粒充分溶解；取出96孔培養板振蕩5min，然后在DG-5031型酶聯免疫測定儀上測定570nm光吸收值（A570值），分別計算各濃度阿霉素對兩種細胞生長的抑制率，細胞生長抑制率=（1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100％。根據Bliss方法，利用SPSS15.0軟件計算半數抑制濃度IC50值［5］，再根據IC50值計算耐藥倍數，耐藥倍數=耐藥細胞IC50值/敏感細胞IC50值。

1.2.1.2 測定FAT對K562細胞和K562/A02細胞的毒性作用 方法同1.2.1.1，FAT的終濃度為0、0.01、0.02、0.04和0.08mg/mL。

1.2.1.3 測定FAT對K562/A02細胞耐藥性逆轉的影響 參照李大成等［6］的分組方法，略作修改。用FAT≤IC10（抑制率≤10％時的濃度）的劑量進行耐藥逆轉試驗。收集對數生長期的K562細胞和K562/A02細胞，調細胞濃度為1.25×108cells/L，接種于96孔培養板中，每孔80μL（含1.0×104cells）。兩種細胞均分6組，試驗組Ⅰ加不同濃度的FAT 10μL和RPMI-1640 培養液10μL；試驗組Ⅱ同時加入不同濃度的FAT 10μL和不同濃度的阿霉素10μL，每一劑量復孔數為4。對照組Ⅰ不加細胞，只加RPMI-1640培養液100μL，用于調零；對照組Ⅱ為只加細胞不加任何藥物的陰性對照，加RPMI-1640培養液20μL；對照組Ⅲ為抗癌藥對照，加不同濃度的阿霉素10μL與RPMI-1640培養液10μL；對照組Ⅳ為逆轉劑陽性對照，加入終濃度為10μmol/L的VRP 10μL和不同濃度的阿霉素10μL，每孔終體積均為 100μL。方法同1.2.1.1。

逆轉倍數（fold reversal，FR）=逆轉前 IC50值 /逆轉后IC50值

1.2.2 DTNB法測定FAT對K562/A02細胞內GSH表達的影響［7］取對數生長期的K562細胞和K562/A02細胞，調細胞濃度均為5.6×108cells/L，再將細胞懸液接種于24孔培養板，900μL（5×105cells）/孔，試驗分組：① FAT0.02mg/mL，② FAT0.04mg/mL，③ FAT0.08mg/mL，④ VRP 10μmol/L，按試驗分組分別加入相應濃度的藥物工作液100μL/孔，混勻后在37℃、5％ CO2、飽和濕度的條件下培養，同時取對數生長期的K562/A02細胞和K562細胞，不加逆轉劑，作為對照，48h后收集細胞到離心管中，1500r/min離心2min，棄上清液，用冷PBS洗3次，再加PBS調整細胞數為1×109cells/L，用以測定 K562細胞細胞懸液，經細胞破碎儀破碎細胞，1000 g離心和K562/A02細胞內GSH含量。取上述各組細胞數為1×109cells/L的細胞懸液，經細胞破碎儀破碎細胞，1000 g離心5min，取上清液200μL加100μL 10％磺基水楊酸混勻，1000 g離心5min，去蛋白，用上清液200μL測定OD值。方法同標準曲線的制作。

1.2.3 流式細胞儀測定K562細胞和K562/A02細胞內羅丹明123含量 取對數生長期的K562細胞和K562/A02細胞，調整細胞數濃度為6.25×108cells/L，將細胞懸液接種于24孔培養板，800μL（5×105cells）/孔，兩種細胞各分5組：K562細胞，K+VRP 10μmol/L（K即K562細 胞 ），K+FAT0.02mg/mL，K+FAT0.04mg/mL，K+FAT0.08mg/mL；K562/A02細胞，K/A+VRP 10μmol/L（K/A即 K562/A02細胞），K/A+FAT0.02mg/mL，K/A+FAT0.04mg/mL，K/A+FAT0.08mg/mL，每組3個平行孔，按試驗分組分別加入相應濃度的藥物工作液100μL，同時加入羅丹明123 100μL，終濃度為5μg/mL，終體積為1mL，混勻后置37℃，5％ CO2飽和濕度條件下培養1h，加入冷PBS 2mL終止細胞代謝，收集細胞到離心管中，1500r/min離心2min，棄上清，冷PBS洗兩次，再加1mL PBS制成細胞懸液，采用美國Coulter公司生產的EPICS XL型流式細胞儀，以氬離子激光器為激發光源，激發波長為488nm，最大發射波長575nm，測定數據輸入計算機，用Multicycle軟件分析細胞羅丹明123含量。

2 結果

2.1 K562/A02細胞對ADM的耐藥倍數

K562/A02細胞在阿霉素10.0、20.0、40.0、80.0和160.0μmol/L各個濃度范圍的抑制率見表1，K562細胞在阿霉素0.25、0.5、1.0、2.0和 4.0μmol/L各個濃度范圍的抑制率見表2。根據Bliss方法計算半數抑制濃度IC50。結果顯示，阿霉素對K562細胞 的 IC50為 2.6μmol/L；K562/A02細 胞 的 IC50為80.0μmol/L。K562/A02細 胞 的 耐 藥 倍 數 是 30.7（表 3）。

表1 ADM對K562/A02細胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

表1 ADM對K562/A02細胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

?

表2 FAT與阿霉素聯合作用對K562細胞增殖的抑制率（％，±s，n = 4）

表2 FAT與阿霉素聯合作用對K562細胞增殖的抑制率（％，±s，n = 4）

?

2.2 FAT對K562細胞和K562/A02細胞增殖的影響

K562細胞和K562/A02細胞在FAT濃度為0.01、0.02、0.04和0.08mg/mL 濃度范圍的抑制率見表4。結果顯示，K562細胞和K562/A02細胞在0.01-0.08mg/mL范圍內對細胞生長的抑制率均≤5％，可以認為在此濃度下對細胞無直接毒性作用，因此可作為逆轉劑的劑量。

表3 FAT與阿霉素聯合作用對K562/A02細胞的抑制率（％，±s，n= 4）

表3 FAT與阿霉素聯合作用對K562/A02細胞的抑制率（％，±s，n= 4）

?

2.3 FAT對K562/A02細胞耐藥性的逆轉作用

在 VRP（10μmol/L）、FAT（0.01、0.02、0.04 和0.08mg/mL）濃度時，ADM對K562/A02細胞的逆轉倍數分別為7.8、2.2、4.0、21.3和42.1。結果顯示，FAT與逆轉劑VRP一樣，可逆轉K562/A02細胞對ADM的耐藥性，其濃度為0.04和0.08mg/mL時逆轉倍數高于VRP；FAT可增強ADM對K562/A02細胞的生長抑制作用，且與劑量相關，而對K562細胞無顯著影響，詳見表2、表3和表5。

表4 FAT對K562細胞與K562/A02細胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

表4 FAT對K562細胞與K562/A02細胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

?

2.4 FAT對K562/A02內GSH含量的影響

DTNB法檢測結果（表6）顯示，K562/A02細胞 內 GSH 含 量（231.54μmol/106cells） 遠 遠高 于K562細 胞 內 GSH 含 量（58.03μmol/106cells）， 為K562細胞的3.99倍；FAT可減少K562/A02細胞內 GSH 含量，VRP（10μmol/L）、FAT（0.01、0.02、0.04和0.08mg/mL）作用48h后，K562/A02細胞內GSH含量從231.54μmol/106cells分別減少到96.95、212.89、161和 122.35μmol/106cells，但仍高于 K562細胞內GSH含量，說明FAT可減少K562/A02細胞內GSH的表達，并且與劑量相關，但是效果沒有VRP顯著。

2.5 FAT對K562和K562/A02細胞內羅丹明123積聚濃度的影響

表5 FAT對K562細胞與K562/A02細胞耐藥性的逆轉作用

阿霉素、柔紅霉素是治療急性白血病的常用化療藥物，它們是通過抑制細胞內DNA的合成而發揮作用，監測白血病細胞內的阿霉素或柔紅霉素濃度對臨床療效的預測有很大意義。同時阿霉素、柔紅霉素化療常導致白血病細胞的獲得性耐藥-多藥耐藥，耐藥的白血病細胞常使細胞內藥物的排出增加，使細胞內藥物濃度降低，導致化療失敗，所以抗癌藥物的濃度測定是多藥耐藥研究的重要課題［8］。用羅丹明123（Rhodamine 123）熒光染料作為被測抗癌藥物的代表在細胞中的積累。因為羅丹明123的結構與阿霉素、柔紅霉素等眾多蒽環類抗癌藥物的結構有許多相同之處（如有芳香雜環、有疏水性、有氮殘基等），并且有強熒光性，容易測定，而且即使濃度很高也不致殺死細胞［9］。

表6 FAT處理K562/A02細胞后的GSH含量分析

圖1 FAT對K562和K562/A02細胞內羅丹明123含量的影響

圖2 流式細胞術分析FAT處理K562細胞后羅丹明123含量圖

流式細胞術檢測結果（圖1）顯示，羅丹明123作用1h后，K562細胞內含量（92.4％）明顯高于K562/A02 細 胞（0.02％）；VRP（10μmol/L）、FAT（0.02、0.04和0.08mg/mL）作用1h后，K562/A02細胞內羅丹明123含量從0.02％分別增加到10.7％、18.3％、38.3％和50.4％，可見，FAT可增加K562/A02細胞內的羅丹明123含量，與劑量相關；但FAT 對K562細胞內羅丹明123含量沒有顯著影響（圖2和圖3）。

圖3 流式細胞術分析FAT處理K562/A02細胞后羅丹明123含量圖

3 討論

多藥耐藥（MDR）是指腫瘤細胞長期接觸某一化療藥物，不僅對此種化療藥物產生耐藥性，而且對其他結構和功能不同的抗腫瘤藥物也產生交叉耐藥性的現象［10］，是造成化療失敗的主要原因。由于腫瘤MDR已涉及臨床常用的多種抗癌藥物，因此，盡快找到可以逆轉腫瘤MDR的方法，以提高臨床療效，改善患者生存質量，延長患者生存期十分緊迫［11］。

Tsurno等［12］發現鈣離子拮抗劑如維拉帕米通過與抗癌藥物競爭P-gp的相關結合位點增加抗癌藥物在細胞內的潴留，Muller等［13］發現維拉帕米使mdrl基因轉錄下調逆轉MDR。鄧琦等［14］通過研究結果證實了通過CIK 與ADR 細胞對K562/ADR 細胞的先后作用，降低了其胞內P-gp 的表達，提高了K562/ADR 細胞內ADR 濃度，增強了ADR 對耐藥細胞的殺傷活性，但是對于多藥耐藥的非P-gp機制卻鮮有報道。

GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的小分子三肽化合物，是細胞內主要的含巰基肽，谷胱甘肽轉移酶系統是存在于動植物體內的重要解毒系統。在人體內，GSH 可與多種化療藥物等氧化性物質結合，加速化療藥物的分解代謝，清除藥物細胞毒性代謝產物，增強對損傷DNA的修復，從而降低化療藥物的細胞毒性作用。細胞內GSH水平增加與癌細胞對烷化劑、阿霉素及鉑類化療藥物耐藥性密切相關［15］，Fojo［16］也發現腫瘤 MDR 細胞內 GSH 含量明顯升高。本試驗也證實K562/A02細胞內GSH含量遠遠高于K562細胞內GSH含量。經無毒劑量的FAT作用后，K562/A02細胞內GSH含量減少，推測FAT可能通過減少GSH的表達或與GSH結合來降低細胞內GSH含量，進而增加了羅丹明123在K562/A02細胞內的積聚濃度從而逆轉MDR，并且與劑量相關。徐玉喬等［17］發現環孢霉素A可以使耐藥細胞GSH含量降低與自由基有關，劉明華等［18］發現川芎嗪通過影響GST降低耐藥細胞內GSH含量，而FAT降低K562/A02細胞內GSH含量的機制和能否在體內試驗中逆轉多藥耐藥有待進一步研究。

本研究提示FAT與化療藥物聯合應用可能會增加白血病及其他腫瘤的化療療效。

4 結論

本試驗顯示了FAT作為有效多藥耐藥逆轉劑的一些藥理學特征：無毒劑量的FAT與化療藥物ADR聯合運用可以降低K562/A02細胞的IC50值，FAT還可以增加羅丹明123在K562/A02細胞內的積聚濃度，降低K562/A02細胞內GSH的含量，且呈劑量相關。推測FAT降低K562/A02細胞內GSH的含量是FAT逆轉MDR的機制之一。

［1］ 張海嫦, 張飛, 武冰, 等.Anxa2和P-gp蛋白相互作用對多藥耐藥乳腺癌細胞遷移與侵襲影響的研究［J］.中華腫瘤防治雜志 , 2012, 19（3）：166-171.

［2］ 秦小清, 梁宇光, 高洪志, 等.五味子甲素對K562/ADR、HL60/ADR、MCF-7/ADR 多藥耐藥逆轉機制的研究［J］.中國藥理學通報, 2011, 27（3）：329-334.

［3］ 齊相薇, 張湘寧, 黃培春.抗腫瘤海洋生物活性物質的研究進展［J］.海南醫學 , 2012, 23（2）：118-121.

［4］ 周建軍, 樂秀芳, 韓家嫻, 等.評價抗癌物質活性的改良MTT方法［J］.中國醫藥工業雜志, 1993, 24（10）：455-456.

［5］ 周一平.用SPSS 軟件計算新藥的LD_50［J］.藥學進展,2003, 27（5）：314-316.

［6］ 李大成, 屈藝, 劉柏林, 等.三種中藥制劑Ams-11、Fw-13、T ul-17逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的研究［J］.華西醫科大學學報 , 1998, 29（1）：16-20.

［7］ Mckee T, Mckee JR.Biochemistry an introduction.2ed.［M］.Mc Graw-Hi11 Companies Inc, 1999：132-134.

［8］ 馬建國, 楊純正, 李 中, 等.白血病細胞內柔紅霉素的測定［J］.藥物分析雜志, 1992, 12（1）：9-11.

［9］ 鄂征, 主編.組織培養和分子細胞學技術［M］.北京：北京出版社, 1994：3-134.

［10］ 李艷紅, 王永華, 李 燕, 等.MDR1基因多態性及其臨床相關性研究進展［J］.遺傳學報, 2006, 33（2）：93-104.

［11］ 齊元富, 聶奔, 李慧杰.中藥逆轉腫瘤多藥耐藥的前景探討［J］.中醫雜志, 2012, （6）：476-478.

［12］ Tsurno T, Lida H, Tsukagoshi S.Overcoming of vincristine resistance in p388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblas-tine by verapami［J］.Cancer Res,1981, 41（5）：1967.

［13］ Muller C, Goubin F, Ferrandis E, et al.Evidence for transcriptional control ofhumanmdr l gene expression by verapamil inmultidrugresistant leukemic cells［J］.Mol Pharmacol, 1995, 47（1）：51-56.

［14］ 鄧琦 , 白雪 , 肖霞 , 等 . CIK 逆轉 K562 /ADR 細胞多藥耐藥作用及其機制探討［J］. 中華血液學雜志, 2011, 32（1）：52-56.

［15］ 季旭明, 江濤, 歐陽兵, 等.溫下方含藥血清對肺腺癌耐藥細胞內GSH、GST-的影響［J］. 山東中醫藥大學學報, 2010, 34（1）：67-69.

［16］ Fojo T, Bates S.Strategies for reversing drug resistance［J］.Oncogene, 2003, 22：7512-7523.

［17］ 徐玉喬, 惠延平, 馬世榮, 等.環孢霉素A逆轉人白血病耐藥細胞系HL-60/ADM后氧自由基水平的變化［J］.中華實驗血液學雜志, 2008, 16（5）：1050-1054.

［18］ 劉明華, 任美萍, 李蓉, 等.川穹嗪對人卵巢癌耐藥細胞株COC1/DDP的逆轉作用研究［J］.重慶醫學, 2011, 40（20）：1982-1987.