一株高產糖化酶生產菌的篩選與鑒定

張文麗 于寒松，2 樸春紅 王舒婷 胡耀輝，2

葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC3.2.1.3）又稱γ淀粉酶（γ-amylase）或淀粉葡萄糖苷酶（Amyloglucosidase），簡稱糖化酶（縮寫GA或G），是世界上應用范圍最廣、最重要的工業酶制劑之一［1］。隨著世界經濟的發展，能源短缺問題日益突出，可再生能源的開發利用問題受到高度重視。而糖化酶作為生產燃料乙醇必須的生物催化劑，在國際國內市場上的需求量大幅度上升，具有廣闊的市場前景。然而，近30年來，糖化酶生產幾乎成為一個被遺忘的角落，很少人繼續從事這一課題的研究，致使菌種退化，產量下降，技術水平停滯不前。因此，開展糖化酶生產技術研究，選育優良菌株，革新生產工藝，已成為當務之急。這一研究不僅有利于傳統酶制劑產業的技術進步，而且對應用酶制劑的相關產業的發展也具有巨大的推動作用［2］。

目前用于真菌分類鑒定的核酸序列分析最常選用的目的片段是rDNA。真菌基因組中編碼核糖體的基因包括4種，28S rDNA、18S rDNA、5.8S rDNA和5S rDNA。真菌中18S rDNA是相對比較保守的序列，進化上變異性較小，且18S rDNA序列較長，相比之下包含了更多的遺傳信息，使得對18S rDNA序列進行分析成為真菌分子學上鑒定菌種的主要方法［3］。本研究通過此方法，結合微生物自身特性對分離得到的一株產糖化酶菌株ZWL-1進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自吉林某豆制品加工廠污水排放口處的土樣。

1.1.2 主要培養基 （1）葡萄糖淀粉培養基：蛋白胨1.0％，酵母粉0.2％，牛肉粉0.3％，氯化鈉0.2％，葡萄糖5％，玉米淀粉1.0％，瓊脂粉1.7％，調pH值至4.6-5.0；（2）發酵培養基：葡萄糖8％，酵母粉0.5％，玉米糖漿1％，豆餅粉2％，磷酸二氫鉀0.2％，硫酸鎂0.02％，調pH值至4.6-5.0；（3）察氏培養基：蔗糖0.3％，硝酸鈉0.2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，氯化鉀0.05％，硫酸亞鐵0.001％，瓊脂1.8％，調pH值至4.6-5.0。

1.1.3 儀器與設備 DL-CJ-IND超凈工作臺，北京市東聯哈爾儀器制造有限公司；DHP120型恒溫培養箱，上海實驗儀廠有限公司；754型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；SY11-Ni電熱恒溫水浴鍋，北京市長風儀器儀表公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；BI2720 PCR熱循環儀，美國應用生物系統公司；GIS-2019凝膠成像系統，上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種初篩 稱取25 g土樣于裝有滅過菌的225mL生理鹽水的三角瓶中，在磁力攪拌器上攪拌均勻，之后靜置5min。采用梯度稀釋法制備10-2-10-6的系列稀釋液，分別吸取1mL均勻涂布于葡萄糖淀粉培養基上，每個處理設3個平行，30℃下培養5d后觀察，在平板上倒入少量0.1mol/L的碘液，靜置10min觀察并測量菌落周圍出現透明圈的直徑（d /cm）和菌落直徑（d /cm）［4］，再將有透明圈的未知菌株落編號并移至斜面培養基上，30℃培養3-5d，保存于4℃下，待下一步篩選。

1.2.2 菌種復篩 液體搖瓶培養：挑取1個單菌落于裝有10mL蒸餾水的小三角瓶中，將菌落打碎后，按5％的接菌量接種于發酵培養基中，培養溫度30℃，轉速200r/min，培養5d。

1.2.3 粗酶液的制備 將發酵結束后的發酵液倒入50mL離心管中，以6000r/min，離心30min，得到的上清液為粗酶液［5］。測定酶活并計算糖化酶產率。

1.2.4 粗酶液酶活測定 經分離得到的糖化酶粗酶液按照GB8267—2006［6］測定標準酶活，空白用煮沸失活的酶液代替，每個樣做3個平行。酶活定義：在40℃、pH4.6條件下每1h生成1mg葡萄糖所需的酶量。

1.2.5 菌株形態觀察 將篩選得到的菌株ZWL-1接到察氏培養基平板上，置于30℃下培養，每隔8h觀察菌落的顏色和形態。待菌絲長到蓋玻片上后，每隔12h于顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗及分生孢子的大小和形態［7］。

1.2.6 菌株ZWL-1總DNA的制備 將制備好的孢子懸浮液接種于察氏液體培養基中，30℃，200r/min振蕩培養5d。用滅過菌的四層紗布過濾，收集菌絲體，在-20℃的冰箱中預冷30min，再用液氮研磨，然后轉移至EP管中，通過改良后的CTAB/NaCl法［8］提取基因組DNA，經1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其DNA的質量后作為PCR反應的模板。

1.2.7 菌株ZWL-1的18S rDNA序列PCR擴增 以基因組DNA為模板，利用自己設計的引物（利用Primer5.0 軟件，根據GenBank發表的真菌18S rDNA保守基因序列設計的一對引物）對18S rDNA 基因進行擴增。引物序列為：上游引物：5'-AGCGAAACTGCGAATGGC-3'；下游引物：5'-CATCCTTGGCAAATGCTTTC- 3'。

50μL PCR 擴增體系：ddH2O 35.5μL，10×Ex Taq buffer 5.0μL，引物各 2.0μL，dNTPmixture 4.0μL，模板1.0μL，Ex Taq0.5μL。PCR 反應條件：94℃預變性4min；94℃變性 30s，55℃復性30s，72℃延伸100s，循環擴增30次；72℃延伸10min，于 4℃結束反應［9］。

1.2.8 18S rDNA序列同源性及系統發育樹構建 登錄 http//：www.ncbi.nlm.nih.gov， 將 測 序 結 果 用BLAST與在GenBank基因庫中的14株其他真菌（表1）的18S rDNA序列進行同源性比對，尋找其同源關系，確定菌屬。應用BIOEDIT 7.0中的Clustal X軟件［10］和MEGA 5軟件［11］經多重比較后構建系統發育樹。

2 結果

2.1 產酶活力較高菌株的篩選

從吉林某豆制品廠污水排放口處土樣中，經反復分離篩選，得到10株生長速度較快、透明圈與菌落直徑之比（HC值）較大的菌株，經初篩和復篩，得到4株液態發酵產酶活力較高的菌株。其中菌株ZWL-1生長較快、透明圈與菌落直徑之比（HC值）較大、酶產率較高，液體發酵酶產率高達12271U/mL，如圖1和表2所示。故選定菌株ZWL-1作為供試菌株進行菌種鑒定。

表1 選自GenBank 中用于比對的真菌菌株

圖1 菌株ZWL-1透明圈

表2 分離菌株HC值和發酵后酶產率

2.2 菌落形態

菌落在察氏培養基上菌落蔓延迅速，孢子成熟后菌落呈白色絨毛狀（圖2），外觀干燥，不透明菌落與培養基的連接緊密，不易挑??；在液體培養基中，振蕩培養，形成白色小球；顯微鏡下觀察到分枝繁茂且具橫隔的菌絲體，菌絲透明，形成多分枝輪廓，分生孢子梗，直立無色，小枝對生，分生孢子褐色球形，若干分生孢子在分生孢子梗上聚集成孢子頭。初步鑒定為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬。

圖2 分離獲得的高產糖化酶菌株ZWL-1的菌落形態

2.3 18S rDNA基因PCR擴增

以提取的ZWL-1的基因組為模板，經PCR擴增后，進行1％瓊脂糖凝膠電泳，獲得一條約900bp的特異性條帶（圖3）。

圖3 菌株ZWL-1的18S rDNA基因 PCR擴增產物

2.4 菌株ZWL-1的18S rDNA序列同源性和系統發育分析

2.4.1 菌株ZWL-1的18S rDNA測序結果 將ZWL-1的18S rDNA PCR擴增產物送去上海生工測序，菌株ZWL-1得到一條長度為905bp的18S rDNA基因片段（已去除引物序列），將序列提交GenBank，得到登錄號為：KC433410。

2.4.2 菌株進化樹的建立 將所獲得的菌株ZWL-1的18S rDNA序列登錄NCBI，通過在線BLAST分析，菌株ZWL-1的18S rDNA序列與黑曲霉（Aspergillus niger）最相似，序列同源性均在99％以上。選取14種與其相似性均為99％以上的已知菌種的18S rDNA基因核酸序列進行多序列排列構建進化樹，如圖4所示。

圖4 菌株ZWL-1 18S rDNA系統發育樹

3 討論

菌種的形態特征是由遺傳物質和生存環境等因素共同決定的，利用基于形態學、生理生化及分子生物學等技術的多相分類鑒定方法現已廣泛應用于微生物分類學研究領域［12］。因此在真菌菌種鑒定和分類時，利用多相分類學技術的綜合使用，是保證分析和鑒定更加準確的必要前提。目前用于鑒定物種的分子標記和分子技術有SCCP、DDGE、DDTE、RFLP、RAPD、16S rDNA及 18S rDNA， 其 中 18S rDNA 已經多次應用于真菌的鑒定。真菌的分類鑒定方法主要有兩大類，一類是表型鑒定，另一類是分子生物學鑒定，對菌體進行形態觀察屬于表型鑒定，而通過18S rDNA 基因序列分析法屬于分子生物學鑒定［13］。本研究中通過對菌株ZWL-1為期1周的形態學定期觀察和顯微鏡下觀測，也只能確定到屬。18S rDNA基因序列法從基因水平明確種屬分類，基因序列分析是以核酸為基礎，受到外界環境影響較小，不依賴于人肉眼觀察，無個體差異，結果偏差比表型鑒定小，是一種相對準確的鑒定方法。

本研究利用自己設計的引物對ZWL-1 18S rDNA基因序列擴增和序列測定，并通過BIOEDIT軟件中的Clustal X軟件將菌株ZWL-1的18S rDNA基因片段序列與14種與其相似性均為99％以上的已知菌種的18S rDNA基因核酸序列進行多序列排列用Neighbor-joining方法［14］構建進化樹，并采用Bootstraping法［15］評估其準確度，最后用MEGA 5軟件進行系統進化分析，從構建的系統進化樹中可以看出，ZWL-1與Aspergillus sp.LQ21共同構成一個分支，并與黑曲霉（Aspergillus niger strain CS1-1）聚成一大支。因此，ZWL-1被鑒定為黑曲霉屬。黑曲霉為半知菌亞門真菌，在察氏瓊脂培養基上生長時，菌絲初為白色，后變黑，常出現黃色區帶，厚絨狀，反面無色或略帶黃褐色。但本研究中篩選得到的菌株ZWL-1，在進行形態觀察培養時其菌絲由始至終為白色，猜測是ZWL-1的原始菌株在受到長期環境的影響發生了表型變異。由于黑曲霉生長發育較快，分泌產生的代謝物種類和性質可能會具有其特殊性，若該菌產酶能力保持穩定并對其再進一步優化，該菌株有可能作為一種新型的工業生產菌株，發揮該菌的生物學功能和實現其生產利用價值，提高傳統糖化酶制劑的發酵產率。

由于糖化酶具有重要的應用價值，國內外越來越多的研究者正在將目光投向糖化酶的基礎研究和工業應用中。接下來我們將進一步研究該菌產糖化酶的結構，如糖鏈在糖化酶活性、穩定性及構象狀態中所起的作用，進一步闡明糖化酶的多型性原因及糖化酶的熱穩定性機制。

4 結論

從吉林某豆制品加工廠污水排放口處土樣中經反復分離篩選得到4株活較高的菌株，經液態發酵產酶優化得到1株產糖化酶活力較高的菌株ZWL-1。結合形態鑒定和 18S rDNA 序列分析的結果，最終確定該菌屬于黑曲霉屬（Aspergillus niger），且測定該菌具有較高的糖化酶活性。

［1］ 王鳳寰, 孟青青.嗜熱糖化酶基因在重組黑曲霉工程菌中的表達及酶學性質初步研究［J］.生物技術通報, 2012（7）：119-125.

［2］ Dohmen RJ.Cloning of the Schwanniomuces occidentalis glucoamylase gene GAM1 and its expression in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Gene, 1990, 95（1）：111-121.

［3］ Neffs JM, Van De Peer Y, Hendiuks L, et al.Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences ［J］.Nucleic Acids Res, 1990,18（Suppl.）：2237-2317.

［4］ 李祖明, 張洪勛, 薛文通.一株高產堿性內切聚半乳糖醛酸酶生產菌的篩選與鑒定［J］.生物技術通報, 2010（2）：178-183.

［5］ 孫俊良, 李新華, 梁新紅.不同碳源對黑曲霉產糖化酶活力的影響［J］.食品科學, 2008（8）：433-436.

［6］ 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會.GB8267—2006食品添加劑 糖化酶制劑［S］.北京：中國標準出版社, 2006.

［7］ 何毅婷, 楊汝德.以18S rDNA 序列鑒定一株產纖維素酶真菌［J］.現代食品科技, 2008（7）：638-640.

［8］ 奧斯伯FM, 布倫特R, 等.精編分子生物學實驗指南［M］.第5版.北京：科學出版社, 2008.

［9］ 胡耀輝, 徐云, 于寒松, 等.北豆腐中主要腐敗微生物的分離與鑒定［J］.食品工程, 2010（9）：108-110.

［10］ Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, et al.The CLUSTAL X windows interface：flexible strategies formultiple sequence alignment aided by quality analysis tools ［J］.Nucleic Acids Res,1997, 25（24）：4876-4882.

［11］ Kumar S, Tamura K, Jakobsen IB, et al.MEGA2：molecular evolutionary genetics analysis software ［J］.Bioinformatics, 2001,17（12）：1244-1245.

［12］ 劉洋, 趙婷, 姚粟.一株芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱放線菌的分離與鑒定［J］.生物技術通報, 2012（10）：210-216.

［13］ 王瑞禮.醫學真菌學-實驗室檢驗指南［M］.北京：人民衛生出版社, 2005：0-69.

［14］ Saitou M, Nei M.The Neighbour-joiningmethod：a newmethod for reconstructing phylogenetic trees ［J］.Mol Biol Evol, 1987（4）：406-425.

［15］ Felsentein J.Confidence limits on phylogenies：an approach using the Bootstrap ［J］.Evolution, 1985, 39（4）：783-791.