鰻鱺病原性氣單胞菌外膜蛋白基因全長的克隆與抗原決定簇分析

郭松林 王玉 關瑞章 馮建軍 林鵬 楊求華

鰻鱺疾病按病原可分為細菌性、真菌性、寄生蟲性、病毒性及其他類型病原五大類，其中細菌性疾病危害十分嚴重，其導致的經濟損失占疾病總損失的90％以上。已發現的歐洲鰻鱺細菌性病原有十幾種，包括氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）、威隆氣單胞菌（也稱維氏氣單胞菌，A.veronii）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）和獸生氣單胞菌（A.bestiarum），愛德華氏菌屬的遲頓愛德華氏菌以及弧菌屬的致傷弧菌、鰻弧菌和非01群霍亂弧菌［1-4］。在我們課題組近10年建立的87株鰻鱺病原菌菌種庫中，有約80％為病原性氣單胞菌。由于氣單胞菌血清型復雜［5］，且具有地緣性與種間特異性［6］，故研制的滅活疫苗難以在養殖生產中應用［7］。解決此問題的途經之一是尋找病原菌間的共同保護性抗原基因片段，以制備預防同種或同屬但血清型不同病原菌所致疾病的基因工程疫苗［8］。革蘭氏陰性病原菌表面的外膜蛋白（Outermembrane proteins，OMP）是革蘭氏陰性菌細胞壁的特有成分，除了在維持菌體外膜結構及物質轉運方面發揮重要作用外，還是一種重要的保護性抗原，能有效激發宿主的體液免疫和細胞免疫，在宿主體內具有良好的免疫原性［9］。同時，某些OMP在多種病原菌間存在高度保守性，可對同屬不同種或同種不同血清型菌株的感染產生交叉保護，從而成為亞單位疫苗最具潛力的抗原候選成分之一［10-12］。

本研究擬采用已分離到的30株鰻鱺病原性氣單胞菌為材料，使用NCBI/GenBank 數據庫檢索獲得多個氣單胞菌的外膜蛋白基因序列，經比對分析后，從嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞胞菌（A.salmonicida）全基因組中釣出特定外膜蛋白的基因全長及該基因以外兩端的序列，據這兩端序列在嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞胞菌中的保守性設計特異性引物，PCR擴增30株病原性氣單胞菌的外膜蛋白基因并對其推導的表達產物進行結構和功能分析，從而為鰻鱺外膜蛋白共同保護性抗原基因工程疫苗的研制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗儀器主要包括高速冷凍離心機（Sigma），臺式離心機H1650-W（湖南湘儀），PCR儀（東勝創新），瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一），生化培養箱（SHP-250）和微波爐（DJ21F-B）等。主要試劑為 Taq 酶（5U/μL），dNTP（2.5mmol/L），10×loading buffer，引物和DNA Marker購自上海捷瑞生物工程有限公司，溴化乙錠（EB）購自百維信公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自BioTeke公司。

30株鰻鱺病原性氣單胞菌由鰻鱺工程研究中心病原菌菌種庫提供，經Biolog自動菌鑒系統（含96個生化指標）分別鑒定到種或屬。其中嗜水氣單胞菌9株；威隆氣單胞菌16株；豚鼠氣單胞菌3株；簡達氣單胞菌1株；另1株僅鑒定為氣單胞菌屬（表 1）。

表1 30株病原性氣單胞菌的鑒定結果

1.2 方法

1.2.1 細菌培養與DNA模板的制備 30株病原菌接種于胰蛋白胨大豆培養基（TSB），28℃培養24h。采用BioTeke公司的試劑盒（離心柱型）提取，提取方法參考試劑盒內的說明書。提取的DNA經1 ％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，紫外分光光度計測DNA含量，調DNA含量為50ng/μL，備用。

1.2.2 病原性氣單胞菌外膜蛋白基因序列的檢索、篩選與比對 利用核酸序列數據庫NCBI/GenBank，以關鍵詞 “outerme-mbrane protein” ＆“Aeromonas”進行檢索。下載包括基因登錄號，基因序列，病原菌來源等外膜蛋白序列的主要信息，建立氣單胞菌外膜蛋白（Aeromonas ＆ outermembrane protein）基因資料庫。選取資料庫中17株700bp以上的外膜蛋白基因序列（GenBank序列登錄號：HQ331525.1，HM-114316.1，GU134620.1，AF146597.2，FJ437031.1，FJ-437030.1，GU196148.1，DQ008470.1，AY442271.1，AY378290.1，AF276639.2，FJ208990.1，EU309491.1，DQ177328.1，AB290200.1，FJ711769.1，AF183931.1），經Clustal X1.83比對分析后，采用Mega4.0軟件構建17條序列的系統發育樹。

1.2.3 引物設計與PCR擴增 參考17條序列的基因比對結果，采用其中4條外膜蛋白（Ⅱ型孔蛋白）基因序列（AF183931.1，AF276639.2，FJ437031.1，FJ437030.1）的高度保守區域（ccgaccgatatcttcaacgagtg），從嗜水氣單胞菌（登錄號：CP000462）和殺鮭氣單胞菌（登錄號：CP000644）基因組全長序列中釣出該蛋白的基因全長及該基因外上游與下游的兩端序列。根據兩端序列在嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的保守性，采用Premier 5.0軟件設計引物，以擴增30株病原性氣單胞菌的Ⅱ型孔蛋白（約1250bp）。上游引物F：5' CTTCGCTGACACAGGGAATAAC 3'，下游引物 R：5' AGACAACGTGAACTGGCG 3'。PCR 擴增反應體系（50μL）：10×PCR Buffer 5μL，dNTP（10mmol/L）0.5μL，引物（10μmol/L）各 0.2μL，Taq 酶（5U/μL）0.4μL，DNA 模 板 2μL， 補無菌水至50μL。反應條件：94℃變性5min，94℃1min，51℃ 1min，72℃ 2min，33 個循環，72℃延伸 l0min，4℃ 保存。

1.2.4 擴增基因的測序與比對分析 PCR反應產物進行1％ 瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照記錄擴增效果。將擴增產物割膠回收后送至Invitrogen公司直接測序，然后用ClustalX1.83比對分析后，采用Mega4.0軟件構建測序結果的系統發育樹。

1.2.5 氨基酸序列的比對分析 將擴增到的10株氣單胞菌基因和網上已經遞交的2個Ⅱ型孔蛋白全長序列翻譯為氨基酸序列后，用ClustalX1.83進行多重比對并列表分析Ⅱ型孔蛋白氨基酸序列的相似性。1.2.6 推導Ⅱ型孔蛋白的結構、親水性與抗原決空簇分析 據擴增得到的10株氣單胞菌的外膜蛋白全長序列，選取其中一株菌（B11）的Ⅱ型孔蛋白DNA全長序列，轉換為氨基酸序列后，用SOPMA程序（http：//www.expasy.ch/tools/）和 SOSUI 法［14］（http：//bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html）分別對推導蛋白進行二級和三級結構預測；以DNAstar軟件的Editseq和Protean程序分別對該蛋白質分別進行親水性與免疫原性分析［13］，通過BioEdit和Clustalx軟件分別對10個氣單胞菌Ⅱ型孔蛋白DNA全長序列進行抗原決定簇及其保守性比對分析。

2 結果

2.1 氣單胞菌外膜蛋白參考序列的系統發育

從17條氣單胞菌外膜蛋白基因序列的系統發育分析結果可知，在黑箭頭處遺傳距離標尺約0.13時，這些序列可分為8個分支，第一個分支有6條序列，其中2條為主要外膜蛋白（DQ008470.1，FJ20899-0.1），3條為推測外膜蛋白（AY442271.1，AF1465-97.2，EU309491.1），1條為外膜蛋白A前體（GU-196148.1）；第2個分支為2條I型外膜蛋白序列（AB290200.1、FJ711769.1）；第 3個分支為 4條Ⅱ型孔蛋白序列（AF183931.1，AF276639.2，FJ4370-31.1，FJ437030.1）。其余5條序列各為1個分支，分別為主要外膜蛋白（DQ008470.1），外膜蛋白前體N（AY378290.1），外膜蛋白（GU134620.1），外膜蛋白W（HM114316.1）和類似外膜蛋白（HQ331525.1）（圖1）。由于前3個分支只有4個Ⅱ型孔蛋白序列有一個高度保守的片段（ccgaccgatatcttcaacgagtg），故使用這個外膜蛋白進行鰻鱺病原性氣單胞菌的外膜蛋白擴增。

圖1 17個氣單胞菌已知外膜蛋白基因片段的系統發育樹

2.2 鰻鱺病原性氣單胞菌外膜蛋白基因全長的PCR擴增

通過PCR擴增30株病原性氣單胞菌的Ⅱ型孔蛋白基因，經瓊脂糖電泳結果（圖2）顯示，有11株 菌（B11、B14、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B60-1、B65）都得到了較單一的PCR擴增產物，擴增出的基因分子量在1200bp左右，與預期目的條帶大小一致，除一株菌（B60-1）外，其余10株菌均測出Ⅱ型孔蛋白的全長序列。

圖2 30株氣單胞菌外膜蛋白基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

2.3 鰻鱺病原性氣單胞菌外膜蛋白基因的系統發育分析

10 個（B11、B14、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B65）Ⅱ型孔蛋白基因全長序列的開放閱讀框在1038bp到1 125bp之間。這10個菌株包括2株威隆氣單胞菌（B53、B53-1）和1株豚鼠氣單胞菌（B14），其余7株為嗜水氣單胞菌（表1）。將10條序列與1條已知Ⅱ型孔蛋白（AF-183931.1）和2條分別從嗜水氣單胞菌（登錄號：CP000462）和殺鮭氣單胞菌（登錄號：CP000644）基因組全長釣出的Ⅱ型孔蛋白序列（seqAh-omp II和seqAs-omp II）進行同源性分析，結果（圖3）表明，除1株豚鼠氣單胞菌（B14）外，其余12個Ⅱ型孔蛋白基因均具有較高的同源性。Mega4.0構建的系統發育樹表明，該基因在菌株間的遺傳距離在0.000-0.358之間，平均為0.179，其中菌株B11與其余菌株在該序列的平均遺傳距離為0.187，接近平均遺傳距離。因此，本研究以該序列的理論表達產物為代表進行蛋白質結構與抗原決定簇分析，從而為該基因的進一步表達和表達產物的免疫原性及交叉保護研究奠定理論基礎。

圖3 13個病原性氣單胞菌Ⅱ型孔蛋白基因全長的系統發育樹

2.4 B11菌株Ⅱ型孔蛋白基因表達產物的結構與功能

2.4.1 二級與三級結構分析 采用SOPMA 程序對B11菌株OMPⅡ的表達產物進行氨基酸分析。結果表明，該基因共編碼 362個氨基酸，其中有78個堿性氨基酸（28個賴氨酸K，9個精氨酸R，41個組氨酸H）和52個酸性氨基酸（36個天冬氨酸D，16個谷氨酸E）；132個非極性疏水氨基酸（39個丙氨酸A，14個異亮氨酸I，24個亮氨酸L，23個苯丙氨酸F，7個色氨酸W，25個纈氨酸V）和163個極性中性氨基酸（23個天冬酰胺N，1個半胱氨酸C，14個谷氨酰胺Q，26個絲氨酸，27個蘇氨酸T，26個酪氨酸Y，42個甘氨酸G，4個蛋氨酸M）；3個脯氨酸P，1個任意氨基酸X。利用SOPMA 程序預測的蛋白質二級結構分析結果（圖4）顯示，此外膜蛋白可形成螺旋（Helix）、片層（Sheet）、轉角（Turn）和卷曲（Coil）等結構；其中α螺旋（Alphahelix Ah）比例約27.81％；未形成β螺旋和γ螺旋；舒展性螺旋（Extended strand Ee）比例約25.00％；β轉角（Beta turn Tt）比例約3.57％；無規則卷曲（Random coil Cc）比例約43.62％；其他結構域為0 。

圖4 SOPMA法預測Ⅱ型孔蛋白基因編碼的蛋白質二級結構

SOSUI 法預測結果（圖5）顯示，外膜蛋白氨基酸序列存在信號肽區和跨膜螺旋區，其中前者由4個氨基酸組成，后者由23個氨基酸組成，其余335個氨基酸均為該外膜蛋白細胞膜外的氨基酸序列，這些膜外序列常認為是可刺激宿主產生免疫反應的保護性抗原。

圖5 SOSUI 法預測Ⅱ型孔蛋白基因編碼的蛋白質三級結構

2.4.2 親水性分析 DNAstar軟件Protean TM程序的Plot-Kyte-Doolittle 法預測結果（圖6）顯示，此外膜蛋白有大約90％以上的區域處于正高分值（縱坐標正值越大，親水性越強），表明該蛋白具有良好的親水性，屬親水性蛋白，此結果為該基因所表達蛋白質的純化提供了有價值的參考。

圖6 Ⅱ型孔蛋白基因表達產物的的親水性分析

2.4.3 抗原決定簇分析 采用DNASTAR軟件Lasergene程序ProteanTM模塊中的Jomeson-Wolf 法預測分析Ⅱ型孔蛋白的免疫原性，結果（圖7）表明此外膜蛋白大約85％抗原峰值大于臨界值0，處于正分處（縱坐標正值越大，免疫原性越強）。根據主要的抗原峰推測該蛋白有15個抗原決定簇，其在蛋白質上的氨基酸順序分別位于24-32、43-53、84-92、94-101、103-112、120-127、157-163、181-187、194-201、237-248、266-274、275-285、307-312、314-322和346-355，指示該蛋白理論上具有良好的免疫原性。

圖7 Ⅱ型孔蛋白基因表達產物的免疫原性分析

2.5 Ⅱ型孔蛋白基因推導氨基酸序列的比對與共同抗原決定簇分析

通 過 BioEdit和 Clustal X軟 件 對 9個（B11、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B65）Ⅱ型孔蛋白基因和3個參考基因（AF183931.1，seqAh-omp II和seqAs-omp II）的氨基酸序列進行比對分析發現，12個孔蛋白的氨基酸序列具有較高的同源性。將這些同源序列與B11菌株的抗原決定簇分析結果進行比較，結果發現6個存在于12株菌中的保守抗原決定簇（圖8，下劃線部分）。這6個抗原決定簇在B11中的氨基酸序列分別為第24-32（YDKDGTTFD），120-127（DGSQYGKI），157-163：（DGRQEGQ），181-187（TNDDQAV），275-285（GYKDKGRGYEL）和 346-355（MDNKDDEWTV）。6個保守抗原決定簇仍然存在少許的差異：第一個決定簇的第7個氨基酸在B53和B53-1中為S，而在其它菌株中為T；第2個決定簇的第2個氨基酸在seqAs-ompII和B11中為S，而在其它菌株中為T，第7個氨基酸在AF183931.1中為V，其他菌株中為I；第3個決定簇的第2個氨基酸在seqAs-ompII中為S，其它菌株中為G；第4個決定簇的第4個氨基酸在B48和B65中為N，其它菌株中為D，但在第5個氨基酸處區別稍大，4個K，3個Q，E和V各兩個，1個T，第7個氨基酸在seqAs-ompII中為E，其它菌株中為V；第5個決定簇的第2個氨基酸區別稍大，有5個Y，4個D，2個N和1個R，第4個氨基酸在B48和B65中為G，其它菌株中為D；第6個決定簇的第3個氨基酸在seqAs-ompII、AF183931.1和B20中為D，其它菌株中為E；第4個氨基酸在B20、AF183931.1、B53和B53-1中為F，而在其他菌株中為W。

3 討論

近年的大量研究發現，魚類病原菌的外膜蛋白（OMP）是疫苗研制的重要保護性抗原［12，13］。隨著基因組學、蛋白質組學及生物信息學等學科的快速發展，越來越多的病原菌OMP基因測序得以完成。根據互聯網數據庫已知OMP的基因序列設計特異性引物，然后從魚類病原菌庫的基因組中擴增目標基因，再利用合適的載體進行重組表達，大大加快了疫苗抗原篩選的速度。這些重組OMP保持了天然OMP的免疫原性和免疫保護作用，均能有效刺激魚體產生特異性抗體［8］，某些OMP還能顯著增強機體吞噬細胞的吞噬活性［15］，并能對相應病原菌的攻毒感染提供50％-100％不等的免疫保護率。隨著研究的深入，目前已發現某些OMP為不同病原菌或同種病原菌不同血清型的共同保護性抗原，免疫后可對多種病原菌的交叉感染提供免疫保護作用。Kawai等［16］分別從3株不同血清型的遲鈍愛德華氏菌中，利用十二烷基肌氨酸鈉抽提、超速離心、免疫印跡、雙向電泳等方法均分離純化到分子量大小約為37kD的OMP。該蛋白免疫日本牙鲆后，對3株病原菌的感染分別提供50％、65.5％和70％的交叉免疫保護作用。Fang等獲得分子量為43kD 的重組OMP，并利用氨基酸序列同源性分析、Western blot 免疫印跡等方法證明該OMP是9株嗜水氣單胞菌和1株溫和氣單胞菌的共同OMP抗原。該重組OMP免疫藍絲鱸后，能夠針對其中2株相同血清型和1株不同血清型嗜水氣單胞菌的感染提供分別為87.5％、75％和44.4 ％的交叉免疫保護率［17］。同時，也可利用融合PCR 技術將多種共同或主要抗原基因進行融合表達，以進一步構建多價重組外膜蛋白疫苗，從而進一步擴大對病原菌的交叉保護范圍［18］。

圖8 12個Ⅱ型孔蛋白基因推導的氨基酸序列的比對

本研究利用核酸序列數據庫NCBI/GenBank，找到氣單胞菌屬的17外膜蛋白基因序列并進行比對，采用相關軟件構建這些序列的系統發育樹；并通過一定的遺傳距離將其分為8個分支，若分支中含有多個序列，則根據其保守區域從嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌基因組全長序列（登錄號分別為CP000462和CP000644）中搜索該基因在基因組中的位置并在該基因之外的上下游約100bp的兩端設計引物，以擴增出該基因序列的全長。本試驗根據圖1的第1、2和4等3個分支分別找到了3個基因在嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌基因組全長序列中的位置，并按上述方法分別設計了3對引物，以30株病原性氣單胞菌的DNA為模板進行擴增。結果發現第4個分支的II型孔蛋白基因能擴增到11個目的基因并測出了其中10個基因的全長序列，其余兩支僅分別能擴增到4株和0株菌的基因（數據未在本論文提供），表明II型孔蛋白可能是存在于鰻鱺源病原性氣單胞菌的主要外膜蛋白［5］。

擴增10株菌的OMP基因序列與3個參考序列比對分析后顯示，B11菌株的OMP基因序列與其它菌株的序列平均遺傳距離居中，有可能成為這些菌株間的交叉保護抗原。此外，B11菌株毒性較強，其對歐洲鰻鱺的半數致死量約為105CFU/g體重［19］，且具有良好的研究背景［5，20-21］。采用該基因約500bp的序列片段構建重組表達載體，其表達的30kD外膜蛋白經皮下注射免疫歐洲鰻鱺后，對嗜水氣單胞菌（B11）和溫和氣單胞菌的攻素毒感染能分別提供50％和70％的相對保護率［12］。免疫原性分析表明，該表達產物有15個抗原決定簇，其中14個決定簇位于該蛋白的細胞膜外區域，有望在病原性氣單胞菌間產生廣泛的交叉免疫保護作用［18，22］。因此，本研究采用的免疫原性分析軟件對II型孔蛋白基表達產物的理論分析具有較好的預測能力。另外，對12個基因序列推導的氨基酸序列進行比對分析后，發現存在于多株鰻鱺病原性氣單胞菌間的6個較為保守的抗原決定簇，提示該基因表達的OMP很可能對多株病原菌的感染產生交叉保護，有待于進一步研究證實。

B11菌株擴增基因推導OMP的二級結構顯示，該蛋白有362個氨基酸，能形成的螺旋（Helix）、片層（Sheet）、轉角（Turn）和卷曲（Coil）等結構，提示其具有復雜的空間結構；三級結構分析表明該蛋白具有信號肽、跨膜區和膜外區域，而膜外蛋白區域通常直接暴露于魚類的免疫系統，易被免疫系統識別并產生有效的免疫反應［8，12］。因此，二級與三級結構分析為該蛋白的免疫原性研究奠定了堅實的理論基礎［23］。此外，該OMP的親水性分析表明其親水性較高，此結果為該表達蛋白的進一步純化提供了有價值的參考［24］。值得一提的是，本研究材料中的30個菌株包含4種細菌，從1株豚鼠氣單胞菌（B14）擴增到的該基因與其他9個基因同源性很低，未從簡達氣單胞菌（B29）中擴增到該外膜蛋白基因，因此，B11菌株表達的OMP對這兩個菌種的免疫交叉保護也有待于研究證實。然而，我們的研究表明，嗜水氣單胞菌和威隆氣單胞菌為近10年從養殖的發病鰻鱺分離的主要菌株［21，25］，以本研究為基礎研制的外膜蛋白共同保護性疫苗將具有良好的應用前景。

4 結論

比對17個氣單胞菌己知外膜蛋白基因序列，獲得其中一種外膜蛋白（Ⅱ型孔蛋白）基因的保守片段，通過該片段從嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌基因組中釣出該基因全長。據該基因以外兩端的序列設計特異性引物，以30株鰻鱺病原性氣單胞菌基因組DNA為模板，擴增并獲得10株菌的Ⅱ型孔蛋白基因全長。經遺傳距離分析后選擇一株菌（B11）的Ⅱ型孔蛋白基因，該基因的表達產物具有三級結構，親水性強且有15個抗原決定簇，其中6個為存在于9株鰻鱺病原菌間的保守抗原決定簇。

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