全麻手術患者外周血單個核細胞DNA損傷及臨床意義

肖 憬，詹 翔，桑圣剛

應激反應及繼發的氧化損傷及炎性反應是手術及麻醉對患者全身性損害的一種形式［1-2］，在手術過程中，雖然麻醉可以在一定程度減輕疼痛、牽拉等對機體的不良刺激，但是植物神經系統對創傷刺激的反應并不能完全被阻斷，機體仍處于創傷應激的狀態，體內耗氧量增加，氧自由基生成增多。組織器官在血流阻斷、牽拉等手術過程中，不斷發生組織器官局部的缺血缺氧，在恢復血液灌注后會發生非典型的缺血再灌注損傷。氧自由基大量生成，抗氧化系統活性下降，加重對機體的損傷［3］。本研究觀察76例全麻手術患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)DNA的改變情況，同時測定患者血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量，為手術過程中加強生命體征監測提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年9月—2011年12月在海南醫學院附屬醫院手術室行全麻的手術患者76例，男43例，女33例;年齡5～65歲。其中胃癌26例，直腸癌15例，肺癌27例，肝破裂3例，腸壞死5例。

1.2 儀器 電泳儀(北京市六一儀器廠DYY-7B型)，熒光顯微鏡(日本尼康E800)，低溫冰箱(青島海爾)，離心機(安徽科大創新有限公司中佳分公司KDC-1042)，凝膠成像系統(德國 Herolab UVT-28)，彗星圖像分析系統(捷克LUCIATMCOMET)。

1.3 試劑 percoll分離液(美國Ameisco公司)，兔抗人Ⅷ因子相關抗原、FITC標記的羊抗兔IgG熒光抗體(美國ADI公司)，正常熔點瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、月桂酰肌氨酸鈉、TritonX-100、Thris-HCl(美國Ameisco公司)，Na2-EDTA、二甲基亞砜、溴化乙錠、胎盼藍(西安華美公司)，蛋白酶K(德國默克公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 方法

1.4.1 麻醉方法:術前常規肌內注射阿托品0.5 mg、苯巴比妥100 mg。開放靜脈通道，乳酸林格液輸注保持靜脈通道通暢，給予面罩吸氧，依次靜脈注射咪達唑侖 0.15 ～0.2 mg/kg、芬太尼 0.2 mg、琥珀酰膽堿2 mg/kg誘導，90 s后行氣管插管。氣管插管后機械通氣，潮氣量為10 ml/kg，呼吸頻率為12/min。吸入1% ～2%異氟醚，靜脈分次推注維庫溴銨(0.05 mg/kg)，微量泵靶控持續泵入芬太尼維持麻醉。

1.4.2 PBMC提取:采集麻醉日晨空腹、麻醉后1 h及術后 2 d空腹靜脈血 10 ml，分別置于含0.109 mol/L的枸櫞酸鈉負壓管中，立即顛倒混勻。用ficoll密度離心法分離PBMC，用RPMI 1640調細胞濃度為1×106/L，在光鏡下用臺盼藍法檢測活細胞率＞95%，制成細胞懸液備用。

1.4.3 單細胞凝膠電泳［4］:45℃下將濃度為10 g/L的正常熔點瓊脂糖150 μl涂在磨砂載玻片上，加蓋玻片輕壓，于4℃凝固10 min制成第一層膠;37℃下將含1000個細胞的懸液150 μl與等體積濃度為5 g/L的低熔點瓊脂糖混合均勻，取150 μl滴在第一層膠上，加蓋玻片輕壓，于4℃凝固10 min制成第二層膠;37℃下取濃度為5 g/L的低熔點瓊脂糖100 μl涂在第二層膠上并加蓋玻片輕壓，于4℃凝固10 min制成第三層膠。小心去掉蓋玻片，將包埋了細胞的載玻片小心放入細胞裂解液中，置于4℃下1.5 h。取出載玻片，緊密排列于水平電泳槽中，加入電泳緩沖液，4℃解旋20 min。在電壓32 V，電流300 mA，4℃電泳25 min。電泳后小心將載玻片浸于中和液2次，每次15 min。用濃度為20 μg/ml的溴化乙錠染色20 min，加蓋玻片。在熒光顯微鏡(400倍)下觀察，每片計數100個細胞，用彗星圖像分析系統分析細胞彗星率和彗尾DNA含量。

1.4.4 SOD、MDA的檢測:按試劑盒說明進行操作，應用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD活性，硫代巴比妥酸法測定血清MDA濃度。

1.5 統計學方法 應用SPSS 11.5軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 單細胞凝膠電泳結果 熒光顯微鏡下觀察到血液中表現為拖尾的熒光圖像的PBMC，呈“彗星”狀，稱彗星率。全麻手術患者麻醉1 h彗星率及彗尾DNA含量高于麻醉前，差異有統計學意義(P＜0.05)，術后2 d彗星率及彗尾DNA含量與麻醉前比較差異無統計學意義(P＞0.05)，與麻醉1 h比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 全麻手術患者外周血單個核細胞彗星率、彗尾DNA含量(±s，%，n=76)

表1 全麻手術患者外周血單個核細胞彗星率、彗尾DNA含量(±s，%，n=76)

注:與麻醉前比較，aP ＜0.05;與麻醉1 h比較，cP ＜0.05

含量麻醉前時間 彗星率 彗尾DNA 28.95 ±2.13 13.16 ±3.43麻醉1 h 64.47 ±6.75a 39.47 ±3.52a術后2 d 33.62 ±3.27c 14.37 ±4.18c

2.2 SOD、MDA檢測結果 全麻手術患者麻醉1 h SOD活性明顯降低，MDA含量顯著增高，與麻醉前比較差異均有統計學意義(P＜0.05);術后2 d SOD活性升高，MDA含量降低，與麻醉前比較差異無統計學意義(P＞0.05)，與麻醉1 h比較差異有統計學意義(P ＜0.05)，見表2。

表2 全麻手術患者外周血中超氧化物歧化酶和丙二醛的含量比較(±s，n=76)

表2 全麻手術患者外周血中超氧化物歧化酶和丙二醛的含量比較(±s，n=76)

注:與麻醉前比較，aP ＜0.05;與麻醉1 h比較，cP ＜0.05

時間 超氧化物歧化酶(U/L) 丙二醛(μmol/L)麻醉前105.0 ±11.2 15.2 ±5.7麻醉 1 h 45.0 ±9.3a 141.3 ±28.7a術后 2 d 98.4 ±10.7c 14.7 ±6.3c

3 討論

全麻手術中可因呼吸、循環功能紊亂而引起機體缺氧性損傷，產生大量氧自由基［5］。氧自由基是強烈的DNA斷裂劑［6］，可直接攻擊DNA，導致DNA單、雙鏈斷裂，并呈量－效及時－效關系［7］。

本研究應用單細胞凝膠電泳技術檢測外周血PBMC DNA損傷情況，在電場力的作用下，受損PBMC細胞核中帶陰電荷的DNA斷片在凝膠分子篩中向陽極移動，形成“彗星”狀圖像，DNA鏈缺口越多，進入尾部的DNA越多，表現為尾長增加，未損傷細胞在電泳中DNA仍停留于核中形成圓形熒光團。計數細胞彗星率和彗尾的熒光強度可以定量反映群體細胞中DNA鏈斷裂損傷程度［8-9］。電泳結果發現全麻手術患者麻醉1 h彗星率及彗尾DNA含量高于麻醉前，術后2 d彗星率及彗尾DNA含量低于麻醉1 h，差異有統計學意義，與麻醉前相比差異無統計學意義。提示在全麻狀態下，患者存在一定程度的缺氧情況。這與Jugdutt［10］的觀點一致。分析原因可能是全麻狀態下一定程度的缺氧觸發了氧自由基的釋放，引起PBMC損傷的瀑布樣反應，使一氧化氮合酶和一氧化氮含量下降，嗜中性粒細胞活化，細胞因子增多并產生更多的氧自由基，進一步加重PBMC的損傷;氧自由基大量產生，外周血抗氧化能力下降，導致氧化性DNA損傷、斷裂［11］。

SOD能夠清除氧陰離子自由基，保護細胞，間接反映了機體清除氧自由基的能力;MDA為氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成的脂質過氧化分解產物，其含量的變化可反映出組織細胞氧化損傷的程度［12］。這兩個指標反映了體內自由基的氧化和抗自由基的水平。本研究表明，全麻手術患者麻醉1 h SOD活性明顯降低，MDA的含量顯著增高，與麻醉前相比差異有統計學意義;術后2 d SOD活性明顯升高，MDA顯著降低，與麻醉前相比差異無統計學意義，與麻醉1 h相比差異有統計學意義。與國內研究相一致［13-14］。結合PBMC DNA的損傷情況，分析原因為:全麻患者在手術過程中，除了手術本身的影響外，患者本身存在一定程度的缺氧。缺氧的程度與PBMC DNA的損傷程度、SOD的下降程度及MDA的升高水平相一致［15］。因此，在手術過程中如何糾正患者的缺氧，對減少患者手術過程氧自由基的產生至關重要。

總之，全麻患者在手術過程中存在不同程度的缺氧，極易引發患者體內氧自由基的大量蓄積，可導致其他并發癥的發生，故對于全麻手術患者在手術過程中早期監測單個核細胞DNA的變化情況可能有利于預防缺氧，對提高手術質量具有指導意義。

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