全蝎純化液對凝血酶誘導血管內皮細胞釋放NO、TFPI及表達TF的影響1）

吳 萍，譚 茜，羅亞君，何義化，陳 博，殷紅艷，許光明

血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）是一種具有廣泛生物活性的細胞，能分泌作用不同的活性物質，以維持血管收縮和舒張、抗凝與促凝平衡[1]。當VEC功能受損時，其合成分泌功能失調，使血液呈高凝狀態。因此與心腦血管系統中的血栓事件發生具有密切關系[2]。近幾年國外研究表明，組織因子（tissue factor，TF）途徑是生理止血的凝血過程和病理血栓形成的啟動環節[3，4]，組織因子是外源性凝血酶途徑的啟動因子，在正常生理活性凝血反應及病理性血栓形成起重要作用[5]。內皮細胞正常情況下并不表達TF，但在某些病理狀態及凝血酶作用下卻大量表達，這些成為目前國外研究的熱點，但在國內研究較少。組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）主要由內皮細胞分泌，具有抗凝、抗血栓等作用。NO是內皮細胞分泌的另一種生物活性物質，具有抑制血小板黏附、聚集及拮抗內皮素，調節TF表達，起抗血栓形成的作用。全蝎（Bathus martesckarsch）臨床多用于治療急性驚風、中風面癱、頭痛、破傷風痙攣等癥，這類疾病常與體內血小板活化、凝血酶形成等高凝狀態，乃至血栓形成有密切關系，抗凝、抗血小板成為治療這類疾病的重要手段[6]。因此抗血栓形成和消除高凝狀態，是治療此類疾病的重要手段之一。已有研究表明，全蝎具有抗凝和抗血栓形成及抑制血小板聚集的作用。為進一步揭示其作用機制，本研究以凝血酶－血管內皮細胞反應為對象，研究全蝎純化液對凝血酶誘導人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）抗凝功能改變的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞由武漢大學典型物種保存中心提供。新生小牛血清（杭州四季青生物制品研究所產品）。RPMI－1640培養基、胰蛋白酶為美國Gibco公司產品，磷酸緩沖鹽（PBS）干粉為武漢博士德公司產品。CO2培養箱為美國謝爾登制造公司產品，酶標儀為芬蘭Labsystens集團產品。凝血酶為中國醫學科學院血液學研究所產品。TF、TFPI試劑盒購自美國Assaypro公司，NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。全蝎購自湖南省醫藥公司，經水煮醇沉、凝膠過濾、離子交換層析等分離純化過程將其真空冷凍干燥成粉末，－20℃保存備用，使用前用含10%小牛血清的RPMI1640培養液配成所需濃度工作液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

1.2 HUVEC培養與鑒定 將內皮細胞加入RPMI－1640培養液（含10%小牛血清、100kU／L鏈霉素、100kU／L青霉素）中，5%、37℃二氧化碳培養箱中培養。倒置顯微鏡下觀察內皮細胞呈多角形、鋪石樣鑲嵌排列，待細胞長滿培養瓶底后用0.25%胰蛋白酶消化傳代，經Ⅷ因子（FⅧ）免疫熒光鑒定并選擇生長良好的HUVECs用于實驗。

1.3 實驗分組及藥物處理 選取生長良好的2代～3代細胞。將融合生長的HUVECs用0.25%胰蛋白酶消化吹打制成單細胞懸液，根據預實驗結果調節細胞密度為7.5×104個／mL，接種于96孔培養板中，每孔200μL。37℃、5%CO2條件下培養。培養的內皮細胞融合后，隨機分為空白對照組，凝血酶（10U／mL）刺激組，全蝎純化液高、中、低劑量組。全蝎純化液高、中、低劑量組加入10U／mL的凝血酶后分別加入24μg／mL、12 μg／mL、6μg／mL全蝎純化液。空白對照組加入等量培養液，每組設10個復孔，置37℃5%CO2培養箱中培養12h進行檢測。

1.4 檢測指標 取細胞培養上清液測定TFPI活性，細胞凍融液測TF活性，均采用發色底物法。NO含量測定采用硝酸還原酶法，嚴格按試劑盒操作說明書操作步驟進行。

2 結 果

2.1 全蝎純化液對凝血酶誘導HUVECs表達TF和釋放TFPI的影響 全蝎純化液各劑量組能抑制基礎條件下HUVECs表達TF，凝血酶能明顯促進HUVECs表達TF，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），而全蝎純化液能顯著抑制其作用（P＜0.01）。HUVECs在基礎條件下能釋放一定量的活性物TFPI，凝血酶能明顯抑制HUVECs釋放TFPI，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），而全蝎純化液能拮抗其作用（P＜0.05）。詳見表1。

表1 全蝎對凝血酶誘導HUVECs表達TF和釋放TFPI、NO的影響（±s）

表1 全蝎對凝血酶誘導HUVECs表達TF和釋放TFPI、NO的影響（±s）

組別 TF活性（%） TFPI活性（%） NO（μmol／L）空白對照組 6.12±1.95 2.05±0.81 7.00±1.32凝血酶組 13.98±1.122） 0.63±0.322） 10.76±1.961）全蝎高劑量組 4.89±0.984） 1.62±0.983） 27.32±3.124）全蝎中劑量組 5.22±0.864） 1.21±0.673） 20.48±2.444）全蝎小劑量組 6.43±1.014） 0.99±0.213） 17.44±2.204）與空白對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與凝血酶組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

2.2 全蝎純化液對凝血酶誘導HUVECs釋放NO的影響HUVECs在基礎條件下能釋放定量的NO，凝血酶促進HUVECs釋放NO，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；全蝎純化液能顯著地促進HUVECs釋放NO，與對照組和凝血酶組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），但凝血酶和全蝎純化液兩者之間無協同作用。詳見表1。

3 討 論

近年來的大量研究表明，與內在凝血途徑相比，組織因子途徑（外源性途徑），在生理性止血過程和病理過程中的血栓形成具有更為重要的意義。TF是一種跨膜糖蛋白，在機體凝血過程中起至關重要的作用，是內、外凝血系統的始動因子，也是血栓形成的關鍵因素。VEC表達的TF是炎癥反應和血栓形成的主要銜接物，研究抑制促VEC誘生性表達的TF物質，已成為防治血栓性疾病的重要策略之一[7]。現已證實，凝血酶能明顯增加HUVECs表達TF，已知TF增加又使凝血酶生成增加，二者具有互相加強效應，這種正反饋作用導致血液促凝活性增加，血小板易黏附、聚集，血栓形成。TF、凝血酶增多，有利于平滑肌細胞遷移、增生，加重內皮細胞損害。本實驗結果顯示，凝血酶能刺激HUVEC大量表達TF，而全蝎能明顯抑制凝血酶所誘導的TF表達，從而起保護血管內皮細胞和抗血栓形成的作用。

TFPI是近幾年發現的一種新型的抗凝物質，是組織因子在體內特異性的生理抑制劑，可以調節TF的活性[8]。它首先和FⅩa結合，然后在Ca2＋存在條件下，再與TF／FⅦa結合形成四聚體，從而抑制FⅩa和TF／FⅦa活性，起抗凝作用[9]。本研究表明，凝血酶能顯著增加HUVEC表達TF，而全蝎純化液能抑制這種作用。凝血酶能明顯抑制HUVEC的TFPI活性使TFPI活性降低。使血液呈高凝狀態，這與國外的研究報告相一致。結果顯示全蝎純化液可提高凝血酶誘導EVC培養液中的TFPI活性，表明其對凝血酶的抑制作用。

NO是內皮細胞分泌的另一種生物活性物質，它可以使血管平滑肌舒張，血壓降低，抑制血小板黏附、聚集及平滑肌細胞增生、遷移，拮抗內皮素、調節TF表達，起抗血栓形成和抗動脈粥樣硬化的作用，以外還可以清除氧自由基等。若內皮受損，NO分泌減少，易導致血管痙攣，成為動脈粥樣硬化發生機制之一。本實驗結果顯示，全蝎純化液能促進內皮細胞釋放NO，這可能與它的凝血化瘀、抗凝、抗血栓形成機制和對心腦血管疾病具有治療作用有關。

以上研究結果顯示全蝎純化液可促進HUVECs合成NO，可拮抗凝血酶抑制TFPI釋放，抑制凝血酶誘導的TF表達，可為臨床合理應用全蝎提供新的理論和實驗依據。

[1]易小民，譚茜，彭延古，等.全蝎純化液對凝血酶誘導血管內皮細胞釋放血管性血友病因子和6－酮－前列腺素F1a的影響[J].中國中西醫結合急救雜志，2010，17（6）：334－336.

[2]賀石林.組織因子途徑及其臨床意義[J].中國實用內科雜志，1997，17（19）：556－558.

[3]Camerer E，Kolst AB，Prydz H.Cell biology of tissue factor，the principle initaltor of blood coagulation[J].Thromb Res，1996，81（1）：1－41.

[4]Sterud B.A global view on the role of monocftes and plates in atherogeneais[J].Thromb Res，1997，85（1）：1－22.

[5]Nemerson Y.The tissue factor pathway of blood coagulation[J].Semin Hematol，1992，29（3）：170－176.

[6]彭延古，黃鶯，易小民，徐愛良.全蝎純化液對凝血酶所致血液凝固的影響[J].中國中西醫結合急救雜志，2010，17（3）：138－140.

[7]McVey JH.Tissue factor pathway[J].Baillieres Best Pract Res Clin Haematol，1999，12（3）：361－372.

[8]成春英，孫勇，文志斌，等.川芎嗪對凝血酶誘導血管內皮細胞組織因子表達的影響[J].南方醫科大學學報，2009，29（8）：1743－1747.

[9]Lwaleed BA，Bass PS.Tissue factor pathway inhibitor：Structure，biology and involvement in disease[J].J Pathol，2006，208（3）：327－339.