銅過量負荷對大鼠學習記憶功能的影響1）

方 向，鮑遠程，金珊，陳懷珍

肝豆狀核變性（WD）是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙疾病[1]，除常見神經系統、肝臟損害癥狀外，研究發現 WD患者的一些高級神經活動記憶和智能等都受到影響，其中腦型WD患者存在有嚴重的記憶障礙，平均記憶商64，有輕度智能障礙，平均總智商為83.87、言語智商為92.60、操作智商為78.73，而無神經系統癥狀的WD患者也存在輕微記憶障礙，記憶商平均為91.75。提示銅（Cu）損害造成的神經細胞損傷對WD患者的學習記憶功能產生了一定的影響[2]。本實驗通過Morris水迷宮試驗，觀察銅對大鼠學習記憶行為和海馬區ERK陽性細胞表達的影響，為WD的基礎研究及WD患者學習記憶功能障礙的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 清潔級健康3個月齡Wistar大鼠40只（安徽省實驗動物中心提供），均為雄性，體重180g～200g（合格證號：SCXR－2011－002）。Morris水迷宮，北京友誠嘉業生物科技有限公司；去離子水由安徽大東方藥業提供；硫酸銅、硝酸為優級純，由合肥大藥房提供；原子吸收分光光度計為北京WFX－1A型；721型分光光度計由上海第三分析儀器廠生產。

1.2 試驗動物及分組 實驗動物采用標準基礎飼料適應性喂養1周后隨機分成正常對照組、模型組，每組20只，動物于專用實驗室中分籠飼養，室溫保持在22℃～25℃，自然晝夜循環非直射光照下生活，自由飲水。

1.3 動物處理 對照組繼續喂食標準基礎飼料，模型組喂飼含硫酸銅1g／kg的粉狀飼料和0.185%硫酸銅的去離子水8周（銅負荷飲食）。

1.4 行為學檢測 銅負荷飲食8周后開始行為學檢測，包括定位航行試驗和空間探索試驗，共進行6d。定位航行試驗：每天2次，歷時5d。開始時將平臺置于水池第三象限，跟蹤記錄大鼠游泳軌跡，將大鼠面向池壁，記錄在2min內尋找到平臺的時間（逃避潛伏期）。空間探索試驗：定位航行試驗完成后撤去平臺，將大鼠由任一入水點面向池壁放入水中，測定在2min內跨越平臺次數。

1.5 標本采集及檢測 行為學檢測結束后每組隨機選取10只大鼠于代謝籠中連續留取3天（72h尿液），搖勻后準確量出尿液體積，加H2SO4混勻，采用原子吸收法測定尿銅含量。

尿銅標本留取后，大鼠在2%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉下，分別留取肝、腦組織標本組織標本先用0.9%NaCl反復洗凈，再用干凈濾紙吸干并秤取濕重，采用濕式消化法消化定容，用原子吸收法測肝、腦組織銅元素含量。

2 結 果

2.1 兩組大鼠組織Cu、24h尿銅水平比較 模型組與對照組比較肝、腦組織的Cu含量及24h尿銅水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 大鼠肝、腦組織的Cu含量及24h尿銅水平變化（±s）

表1 大鼠肝、腦組織的Cu含量及24h尿銅水平變化（±s）

組別 n 肝組織銅μg／g腦組織銅μg／g 24h尿銅mg／24h對照組 10 4.11±0.69 2.02±0.17 2.12±0.57模型組 10 25.37±0.31 3.61±0.12 3.55±0.17 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 空間探索學習記憶能力 在定位航行試驗中，為隨著訓練次數的增加，各組大鼠的平均逃避潛伏期總體呈逐漸下降趨勢，表明各組大鼠均有通過訓練，對水下平臺的空間定位獲得認知并產生記憶的能力。模型組和對照組比較，逃避潛伏期差異有統計學意義（P＜0.01）。

在空間探索試驗中，對照組大鼠大多采取直線方式搜索平臺，而銅負荷模型組沿池壁搜索時間較長，2min內銅負荷組跨越平臺次數明顯少于對照組（P＜0.01）。詳見表2。

表2 大鼠Morris水迷宮實驗比較（±s）

表2 大鼠Morris水迷宮實驗比較（±s）

組別 n 逃避潛伏期（s） 穿越次數（次）對照組 20 21.07±11.05 3.6±2.1模型組 20 35.63±12.07 1.2±1.1 P＜0.01 ＜0.01

3 討 論

銅是人體必需的微量元素，而銅代謝障礙疾病WD引起過量的銅在各器官組織中沉積，則可以引起各器官功能的嚴重損害。學習和記憶是腦的高級神經活動之一，WD造成的銅沉積可以造成神經系統變性引起整個神經系統受累[3]，除常見的錐體外系癥狀外，WD患者還可以出現包括學習成績、記憶力、注意力等在內的神經、心理功能損害的表現。銅是許多功能蛋白如過氧化物歧化酶、酪氨酸環化酶等必需的微量元素，當銅代謝失衡時可以通過對功能分子構象的直接損害和／或造成活性氧族、活性氮族的生成而造成持續的氧化應激反應和線粒體損傷而導致神經元凋亡和神經退行性變，影響了突觸傳導功能，引起神經行為的改變[4]。而銅沉積在肝組織中導致的隱匿性肝性腦病和／或代謝異常也可能影響患者的腦功能。

目前沒有任何一種動物模型可以復制WD的所有臨床特征[5]，本實驗WD模型組大鼠肝、腦組織中銅水平顯著高于對照組，可以確定的是銅負荷飲食可以使大鼠在肝、腦等組織中產生類似WD銅沉積過程[6]。Morris水迷宮作為評價嚙齒類動物空間學習和記憶的試驗方法被廣泛應用于神經生物學、藥學等領域的基礎和實驗研究[7]。本研究中通過研究Morris水迷宮中銅負荷大鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數來反映其空間學習記憶能力的變化，結果表明銅負荷飲食喂養8周后，模型組大鼠與對照組大鼠比較，逃避潛伏期和跨越平臺次數均存在顯著差異，反映出銅負荷模型大鼠在水迷宮試驗中學習定位能力顯著下降，存在著明顯的學習記憶功能障礙。提示銅負荷模型法在一定程度上適用于WD神經心理損害的發病機制和藥物療效評價研究。

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[2]王共強，韓永竹，楊任民，等.肝豆狀核變性患者瘤體智力的神經心理學研究[J].中國臨床神經科學，2005，21（7）：491－493.

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[5]梁秀齡.Wilson病的動物模型[J].中國臨床神經科學，2003，11（1）：88－91.

[6]李毓雯，萬小華，寧琴，等.銅過量負荷導致肝細胞凋亡及其對Bas、Bcl－2基因表達的影響[J].中國當代兒科雜志，2008，21（10）：42－25.

[7]Mura A，Feldon J.Spatial learning in rats is impaired after degeneration of the nigrostriatal dopaminereic system[J].Mov Disord，2003，18（8）：860－871.