高效液相色譜－質譜法檢測血清中維生素D含量

曾 義

(重慶市黔江中心醫院，重慶 409000)

維生素D缺乏不僅與骨質疏松癥和骨軟化癥相關，而且容易導致肌肉力量下降，近年來發現維生素D與癌癥、心血管疾病、糖尿病等都有相關性，足量的體內維生素D水平對癌癥、多發性硬化癥、糖尿病等有一定預防作用[1]。國外研究表明，維生素D的攝入與癌癥的預防呈正相關，血清低水平維生素D與較高的外周動脈疾病發病率存在關聯[2]。維生素D有兩種存在形式，即鈣化醇(維生素D2)和膽固醇(維生素D3)。維生素D狀況評估主要是通過測量循環中血清25－(OH)－D水平。傳統檢測方法采用競爭結合試驗和免疫測定法來檢測循環中總的維生素D(D2和D3)，這些方法中抗體交叉反應性通常不足100%[3]，因此結果差異較大。采用液－質聯用分析技術可克服以上缺點，并定量檢測體內維生素D。

1 儀器與試藥

安捷倫1200型液相色譜儀和安捷倫6430型液質聯用儀。25－(OH)－D2(99.5%)，25－(OH)－D3(99.0%)，均為上海研生生化試劑有限公司;氘代25－(OH)D3(Sigma and Medical lsotopes);甲醇、乙腈為色譜純，甲酸等為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

25－(OH)－D2標準溶液:以甲醇配制 10 μg/mL的 25－(OH)－D2貯備液，在15℃以下儲存，備用;用5%牛血清蛋白的溶液制備 5，10，25，50，100 ng/mL 的不同濃度的標準溶液。25 －(OH)－D3標準溶液配制如25－(OH)－D2對照品溶液配制。以甲醇配置10 μg/mL的氘代25－(OH)－D3貯備液，儲存在15℃以下備用;用去離子水制備400 ng/mL的氘代25－(OH)－D3溶液作為內標貯備溶液。

2.2 測定條件[4]

色譜條件:色譜柱為C18柱，流動相為0.1%甲酸水溶液－0.1%甲酸的甲醇溶液(15∶85)，檢測波長240 nm，柱溫50℃，流速 0.5 mL/min，進樣量 5 μL。

質譜條件:ESI+APCI組合離子源，正離子模式;離子源噴射電壓5 000 V，離子源溫度250℃，離子源噴霧流速5 L/min。此條件下，總離子流色譜圖見圖1。

2.3 樣品前處理

空白血清前處理:用Chromabond C18EC固相萃取柱萃取血清樣品，在250 μL血清中加入1 mL含2%甲酸的乙腈，靜置15 min;將固相萃取柱安裝在其專用真空架上，3 000 r離心10 min，順序用1×1 mL甲醇，1×1 mL甲醇，去離子水(50∶50)淋洗固相萃取柱，然后將離心管的上清液轉移至與預活化的固相萃取柱上。再次用1×1 mL甲醇，1×1 mL甲醇，去離子水(50∶50)淋洗固相萃取柱。開啟真空30 s，然后每個柱子加200 μL正庚烷，靜置2 min，然后將真空開至最大6 min。然后用甲醇和去離子水250 μL 順序洗脫。

血清樣品前處理:用Chromabond C18ec固相萃取柱萃取血清樣品，在250 μL血清樣品中加入內標溶液50 μL，方法同空白血清前處理。

2.4 維生素D2、維生素D3以及氘代內標的分析參數

結果見表1。

2.5 方法學考察

圖1 總離子流色譜圖

表1 維生素D2、維生素D3以及氘代內標的分析參數

線性考察:精密量取2.1項下25－(OH)－D2和25－(OH)－D3標準溶液，加流動相稀釋至質量濃度 5，10，25，50，100 ng/mL，分別進樣5 μL。記錄峰面積，以質量濃度(C)為橫坐標、峰面積(A)為縱坐標作圖，得 25－(OH)－D2和 25－(OH)－D3回歸方程分別為 A=0.015 8 C+0.002 7，R2=0.999 2;A=0.034 8C －0.013 5，R2=0.999 5。結果表明，25－(OH)－D2和 25－(OH)－D3質量濃度在5～100 ng/mL范圍內與峰面積有良好的線性關系。

日內精密度試驗:精密量取2.1項下25－(OH)－D2和25－(OH)－D3標準溶液，流動相配制為 10，25，50 ng/mL 的高、中、低3個質量濃度的25－(OH)－D2和25－(OH)－D3溶液各3份。按2.2項下測定條件，每個質量濃度分別進樣進行含量測定，記錄色譜峰面積。結果25－(OH)－D2和25－(OH)－D3高、中、低3 個濃度日內精密度 RSD 分別為 3.71% ，2.66% ，1.29% 和3.57%，2.21%，1.53%，RSD 均小于 5%，表明日內精密度較好。

日間精密度、穩定性試驗:精密量取2.1項下25－(OH)－D2和25－(OH)－D3對照品溶液，流動相配制為10，25，50 ng/mL的高、中、低3個濃度的25－(OH)－D2和25－(OH)－D3溶液，密封避光于4℃保存。按2.2項下色譜條件，同一溶液進樣含量測定5 d，記錄色譜峰面積，計算供試品測得的質量濃度。計算得25－(OH)－D2和25－(OH)－D3高、中、低3個質量濃度日內精密度RSD 分別為 7.10%，5.25%，4.69%和 6.87%，5.30%，4.03%。結果5 d內含量測定 RSD都小于10%，表明該方法日內精密度好，且5 d內25－(OH)－D2和25－(OH)－D3穩定性較好。

提取回收率:取質量濃度為10，25，50 μg/L的血清標樣50 μL各5份，按2.3項下樣品處理方法處理后，氮氣吹干，殘渣用50 μL流動相復溶解，渦旋 2 min，12 000 r/min離心 10 min，血清處理后25－(OH)－D2和25－(OH)－D3質量濃度的理論推算值為 9.9，24.75，49.5 μg/L 和 9.95，24.87，49.75 μg/L，取 5 μL注入高效液相色譜－質譜儀，測定樣品峰面積A。另用流動相配制 9.9，24.75，49.5 μg/L 和 9.95，24.87，49.75 μg/L 質量濃度的 25－(OH)－D2和 25－(OH)－D3溶液，進樣 5 μL，記錄峰面積 A，按提取回收率公式為提取回收率=A血清/A標準×100%。結果提取回收率分別為 83.23% ，80.55% ，76.34% 和 85.21% ，83.10%，79.44%，RSD 均小于 8%。

回收率試驗:取 2.1項下 25－(OH)－D2和 25－(OH)－D3標準溶液，配制質量濃度為 5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/L 的血漿標樣各5份，按2.3項下血清樣品處理方法處理后，取5 μL注入高效液相色譜－質譜，測定藥物峰面積 A及內標峰面積 A內，計算藥物峰面積與內標的峰面積比值 Y(A/A內)，按回歸方程 A=0.016 0 C+0.002 9，A=0.033 5 C －0.013 8 求出對應質量濃度。結果25－(OH)－D2和25－(OH)－D3的方法回收率分別 為 108.23% ，100.56% ，98.73% ，96.19% ，98.55% 和106.16% ，101.15% ，100.53% ，99.17% ，97.10% ，RSD 分別為7.02% ，5.71% ，4.43% ，3.80% ，2.01% 和 6.72% ，3.14% ，3.49% ，3.32% ，1.65%。

2.5 真實樣品檢驗與檢測限

采用預先定量的新鮮血清樣品對該法進行了驗證，定量結果與以前高效液相色譜法結果相關性良好，相關系數為 R2=0.978。兩種維生素 D的檢測限和定量限分別為2 ng/mL和3 ng/mL。部分樣品含量測定結果見表2。

表2 血清樣品含量測定結果

3 討論

本研究中采用了一種新的液質聯用方法檢測血清中25－羥基維生素D2或D3的含量，采用固相萃取樣品制備方法，有效抑制基質效應和由脂類及血清中其他化合物導致的離子抑制效應。

本試驗中采用高效液相色譜－質譜法進行血清中維生素D的含量的測定，與常規高效液相色譜法、競爭結合試驗、免疫測定法比較，可同時血清中維生素D2和維生素D3的含量，且測定分析時間短，分析結果更準確、可靠，可作為血清中維生素D檢測的新方法，為臨床中合理補充D族維生素、臨床相關疾病的診斷提供參考。

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[2]Chua G，Chan Y.Vitamin D status and peripheral arterial disease:evidence so far[J].Vasc Health Risk Manag，2011，7:671 － 675.

[3]Greta Snellman.Determining Vitamin D Status A Comparison between Commercially Available Assays[J].PLoS One，2010，5(7):e11 555.

[4]陽利龍，銀雪花，祝文兵，等.HPLC測定血清中25－羥基維生素D3和維生素A及應用[J].兒科藥學雜志，2010，1(3):41－42.