頂空氣相色譜法快速測定全血中乙醇與甲醇的含量

趙東玲，王粉安，鄭海波，馬麗霞

(1.西安交通大學醫院，陜西 西安 710061;2.瑞鑫藥業有限公司，陜西 西安 710061;3.西安交通大學醫學院法醫系，陜西 西安 710061)

在打擊假酒和非法勾兌酒案件、酒后駕車事故責任鑒定及臨床上甲醇和乙醇中毒的診斷治療等方面，都需要測定相關事件當事人血液甲醇與乙醇的質量濃度作為判斷指標和證據。甲醇與乙醇的檢測方法有多種[1－5]，如化學法、醇脫氫酶法、氣相色譜法等，但關于全血中甲醇與乙醇同步檢測的報道很少。筆者建立了檢測全血中甲醇與乙醇的快速頂空氣相色譜法(HS－GC)，以外標法定量，結果可靠，操作簡便。現報道如下。

1 儀器與試藥

島津GC－2014C型氣相色譜系統及其工作站;DK－3001A型頂空進樣器(北京中興分析儀器新技術研究所);TB－215D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。乙醇、甲醇均為色譜純試劑;分析用水均為雙蒸水，本實驗室自制。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

色譜柱:AT－PEG－20M 毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);進樣口溫度:200℃;柱溫:40℃;載氣:高純氮氣;檢測器:FID;溫度:250℃;分流比:20∶1;檢測時間6 min;加熱箱溫度70℃;傳輸線溫度110℃;樣品瓶加熱平衡時間10.0 min;取樣針溫度105 ℃;進樣時間 1.0 min;樣品瓶體積 10.0 mL。

2.2 溶液制備

用精密移液器取含有甲醇和乙醇的樣品血0.50 mL加入樣品瓶內，蓋上硅橡膠墊，用密封鉗加封鋁帽，混勻。準確稱取10.004 g甲醇標準品和10.007 g無水乙醇標準品(含量不小于99.9%)，分別置于100 mL容量瓶中，添加雙蒸水至刻度，混勻，得100 g/L甲醇和乙醇貯備液，并將貯備液稀釋得到質量濃度為 50，25，10，5，2.5 g/L 的甲醇和乙醇標準使用液。密封，冷藏保存。

2.3 檢測條件選擇

色譜條件:參考有關文獻，并結合實驗室儀器條件，進樣口和檢測器溫度如2.1項，色譜柱溫度依次設定為60，50，40℃，考察甲醇與乙醇的分離效率。結果發現在較高柱溫(50℃和60℃)時甲醇與乙醇的分離度差，60℃時兩物質的色譜峰甚至部分重疊。但當柱溫為40℃時甲醇和乙醇可達基線分離，峰形良好，出峰穩定(見圖1)。兩 物 質 的 保 留 時 間 分 別 為 甲 醇(3.69±0.01)min，乙 醇(4.50±0.03)min。在此條件下，未見血液中內源性物質的干擾。

圖1 氣相色譜圖

樣品平衡溫度:取0.475 mL空白血樣，分別添加50 g/L的甲醇質量標準使用液15 μL和50 g/L的乙醇標準使用液10 μL，得到甲醇質量濃度為1.5 g/L、乙醇質量濃度為1.0 g/L的空白添加血樣，考察45～75℃之間血液樣品平衡溫度對檢測的影響。平衡時間均為10 min。在各個設定溫度條件下分別檢測3個平行樣品，記錄峰面積并計算 RSD。結果見表1。可見，甲醇和乙醇的峰面積隨溫度的升高而增加，在70℃和75℃時，甲醇和乙醇的峰面積變化最小，且在70℃兩種物質的 RSD最小，檢測結果穩定，故選擇70℃作為樣品平衡溫度。

表1 平衡溫度與血液中甲醇和乙醇峰面積的關系(n=3)

2.4 方法學考察

線性關系考察:取0.48 mL空白血樣，分別添加10 μL質量濃度為 2.5，5，10，25，50，100 g/L 的甲醇和乙醇標準使用液，得到質量濃度為 0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 g/L 甲醇和乙醇標準溶液，分別進樣檢測，以血液中甲醇和乙醇的質量濃度為橫坐標(X)、甲醇和乙醇的峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程，甲醇 Y=12 147 X －27.654，r=0.999 7;乙醇 Y=13 317 X －75.328，r=0.999 9。甲醇與乙醇的最低檢出限為 0.01 g/L。

精密度與回收試驗:取甲醇與乙醇配制質量濃度均為0.1，1.0，2.0 g/L的高、中、低3個質量濃度的空白添加血樣，每個質量濃度各取份，以所建方法在3 d內進行檢測，記錄甲醇與乙醇峰面積，計算日內和日間精密度。同時計算測得量，按照測得量和添加量之比計算回收率(見表2)。結果表明，該方法具有較好的回收率。

表2 甲醇和乙醇的回收率和精密度(n=6，%)

干擾試驗:在空白血樣中加入乙醛、正丙醇、異丙醇、正丁醇、乙酸乙酯，在此條件下進行檢測，這些物質峰形良好，分離度不低于1.5，對甲醇和乙醇的檢測無干擾。

2.5 樣品含量檢測

取一送檢的飲用可疑假酒者的血液，用上述所建立的方法檢測，結果檢出甲醇含量為0.12 g/L，乙醇含量1.36 g/L。

3 討論

在血液乙醇的頂空氣相色譜檢測中，常用叔丁醇作為內標。但當有甲醇存在時，在建立頂空和氣相色譜分析條件過程中發現叔丁醇與甲醇的出峰時間相近，互相干擾，兩者無法區分。因此，本研究未采用內標法，而用外標法檢測血液中的甲醇和乙醇。但在干擾試驗中發現，乙醛、正丙醇、異丙醇、正丁醇、乙酸乙酯對甲醇和乙醇的檢測均無干擾，而乙醛、正丙醇、正丁醇、乙酸乙酯常被作為酒類檢測中的目標物，故在以后的研究中可考慮用異丙醇作為內標。所建立的方法同步檢測全血中的甲醇和乙醇，樣品處理簡單，兩者分離良好，回收率高，重復性好，無內源性物質干擾，分析時間短，為實際應用提供了快速的檢測方法和依據。

[1]GB/T5009.48－2003，中華人民共和國國家標準(食品理化檢驗部分)[S].

[2]謝廣明，潘叫全，劉澤春.人體組織和血液中殘留甲醇檢測方法探討[J].公共衛生與預防醫學，2010，21(3):83.

[3]林 佶，段毅宏，余曉萍.人體血液中甲醇的GC/MS定性定量分析[J].職業與健康，2005(2):213－214.

[4]李勇勤，謝秀紅，許廣榮，等.毛細管色譜柱頂空氣相色譜法測定血中甲醇的含量[J].現代預防醫學，2008(18):3 589－3 590.

[5]代 娟，陳 曼，賴 翼，等.直接進樣毛細管氣相色譜法測定血液中乙醇含量的研究[J].中國衛生檢驗雜志，2010(2):283－284.