反相高效液相色譜法同時測定清熱化毒丸中黃芩苷和漢黃芩素含量

劉 匯，趙 晶，李 琨

（1.吉林省延邊朝鮮族自治州食品藥品檢驗所，吉林 延吉 133000; 2.吉林省通化東寶藥業股份有限公司，吉林 通化 134123； 3.吉林省延邊朝鮮族自治州工業和信息化局，吉林 延吉 133000）

清熱化毒丸是由黃芩、連翹、青黛、黃連等15味中藥加工而成的中成藥制劑，具有清火化毒、消腫止痛的功效。有關清熱化毒丸質量控制都是采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中單一成分，沒有同時測定制劑中多種成分的含量。本試驗中采用HPLC法同時測定制劑中黃芩苷和漢黃芩素兩種成分的含量，以尋求建立同時測定制劑中多種成分來控制制劑質量的方法，可為控制清熱化毒丸質量標準評價方法提供科學依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(四元泵，DAD檢測器，自動進樣器)，十萬分之一天平（賽多利斯）。色譜甲醇（天津市科密歐化學試劑開發中心），甲醇為分析純（北京化工廠），水為娃哈哈純凈水，磷酸為優級純（北京化工廠）；黃芩苷對照品（批號為110715－200514），漢黃芩素對照品（批號為 1514－200001），均購于中國藥品生物制品檢定所；清熱化毒丸（北京同仁堂藥業股份有限公司，批號分別為 9013142，9013006，0013010）。

2 方法與結果[1]

2.1 色譜條件

色譜柱為 Waters SunFire C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇（A）－0.4% 磷酸溶液（B），梯度洗脫，[0～9 min，A：45%(體積分數，下同)；9～25min，A：45% →55% ；25 ～36，A：55%]，流速為 1.0mL ／min，檢測波長 278 nm，柱溫 35 ℃ 。

2.2 溶液制備

精密稱取黃芩苷對照品和漢黃芩素對照品適量，加70%甲醇制成每 1 m L含黃芩苷 84μg、含漢黃芩素13.6μg的混合溶液，即得對照品溶液。取本品10丸，剪碎，取約1.0 g，精密稱定，置 50 m L量瓶中，加入70%甲醇 40 m L，浸泡 20 min，超聲處理40 min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按清熱化毒丸制備工藝，取缺黃芩藥材的其余各味藥，制成陰性樣品，取該陰性樣品按2.3項下方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，按2.1項下的色譜條件，注入液相色譜儀，結果顯示供試品與對照品溶液均在相同保留時間內出現吸收峰，黃芩苷峰和漢黃芩素峰保留時間分別為9.9，32.9 min，理論板數分別大于6 000和30 000，陰性對照樣品溶液在黃芩苷峰和漢黃芩素峰相應位置處無吸收峰，本測定無干擾，見圖1。

線性關系考察：精密稱取黃芩苷對照品和漢黃芩素對照品適量，置50 mL量瓶中，加70%甲醇制成每1mL含黃芩苷84μg，含漢黃芩素13.6μg的對照品貯備液，再用70%甲醇稀釋成系列對照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，并以峰面積為縱坐標，以對照品進樣量（μg）為橫坐標，經線性回歸，得回歸方程，黃芩苷為 Y＝2 709.2X ＋20.09，r＝0.999 9；漢黃芩素為 Y＝5 064X ＋4.5，r＝0.999 9，結果表明，黃芩苷和漢黃芩素進樣量分別在 0.168～0.840 μg和 0.027～0.136 μg范圍內與相應峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取上述黃芩苷和漢黃芩素對照品溶液10μL，按上述色譜條件，連續進樣6次，測定峰面積，計算 RSD分別為0.9%和1.1%，說明該方法具有良好的精密度。

穩定性試驗：取同一批號樣品，按供試品溶液的制備方法操作，分別于 0，1，2，3，4，5，6 h 精密吸取 10 μL 進樣，測得黃芩苷和漢黃芩素峰面積的 RSD分別為0.9%和1.3%。結果表明，樣品至少在6 h內穩定。

重復性試驗：取同一批號樣品6份，按供試品溶液的制備方法操作，分別制備供試液，測得黃芩苷和漢黃芩素平均含量分別為 0.236%和 0.046%，RSD分別為 1.0%和 1.1%。結果表明，該試驗重復性良好。

加樣回收試驗：采用加樣回收法，取已知含量的樣品，精密稱定，分別精密加入一定量的黃芩苷和漢黃芩素對照品，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按上述測定方法進行測定，計算回收率，結果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，按照上述含量測定方法測定，測定結果見表2。

表2 3批樣品含量測定

3 討論

經紫外－可見分光光度計在200～400 nm對黃芩苷和漢黃芩素進行全程掃描得到光譜圖顯示，黃芩苷在280 nm和315 nm有最大吸收峰，漢黃芩素在278 nm有最大吸收峰，綜合考慮，在278 nm處測定含量基線平穩，可以兼顧黃芩苷最大吸收波長，并均達到基線分離，故確定本文檢測波長為278 nm。

本文對多種流動相進行了考察，分別比較了甲醇－水、乙腈－水等不同的流動相系統，并加入磷酸為改性劑。結果以甲醇－水為流動相，以0.4%磷酸為改性劑，梯度洗脫，各成分峰形較好，分離度高[2]。

對3批不同批次的樣品黃芩苷和漢黃芩素含量進行了測定，結果3批樣品平均含量相當，可作為該制劑的質量控制標準。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：282.

[2]高曉燕，盧建秋.梔子金花丸中梔子苷、黃芩苷、番瀉苷A和番瀉苷B的含量測定方法研究[J].中國中藥雜志，2009，34（20）：2 649 － 2 651.