酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝研究

王兆豐， 張 繼， 武偉國(guó)， 于 佳

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070)

茶多酚是一種性能優(yōu)良的天然食品添加劑和效果顯著的醫(yī)藥保健品，應(yīng)用領(lǐng)域十分廣闊［1］，我國(guó)于1990年制定了相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，開(kāi)始在食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)和日用化工業(yè)等領(lǐng)域廣泛地應(yīng)用［2］。研究表明，茶多酚安全無(wú)毒，具有清除自由基、抗氧化、抗艾滋病、抑制腫瘤、抑制乙肝病毒和調(diào)節(jié)免疫力等作用，對(duì)人體多種病癥的預(yù)防與治療起著重大作用［3-5］。茶多酚的主要成分是兒茶素類(lèi)，同時(shí)含有少量咖啡因?？Х纫蚰艽龠M(jìn)人體生熱和脂肪氧化，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮［6］，具有強(qiáng)心、利尿的作用，但過(guò)量攝取可能產(chǎn)生失眠、墮胎或流產(chǎn)、神經(jīng)過(guò)敏等有害作用［7］。因此，茶多酚中的咖啡因量決定了茶多酚的應(yīng)用范圍，在醫(yī)藥保健領(lǐng)域，咖啡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)要求低于1%，在其它應(yīng)用領(lǐng)域?qū)Х纫蛄坑钟兄厥獾囊螅?］。普通商品茶多酚中咖啡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～10%，遠(yuǎn)高于茶葉中的咖啡因量。人們一直在探索從茶多酚中脫除咖啡因的方法，常用的有層析法、吸附法、離子沉淀法、有機(jī)溶劑或超臨界CO2萃取法和微生物或酶降解法等，其中吸附法相對(duì)應(yīng)用較廣?？Х纫蚓哂卸嗔u基嘌呤環(huán)和共軛雙鍵，易被多孔性物質(zhì) (如活性炭、硅藻土、活性黏土和纖維素等)所吸附，酸性白土主要指玻璃質(zhì)火山巖分解后的產(chǎn)物，其主要化學(xué)成分是Al2O3、SiO2、水及少量鐵、鎂、鈣等，無(wú)可塑性，具有多孔性和較強(qiáng)吸附性，吸水后不膨脹。本實(shí)驗(yàn)使用酸性白土，探究其脫除茶多酚中咖啡因的最佳工藝條件。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料 隴南夏秋茶葉:甘肅康縣茗芝茶葉有限公司，粉碎，過(guò)60目篩。

1.2 試劑 沒(méi)食子酸 (GA，≥98%)、兒茶素 (C，≥98%)、表兒茶素 (EC，≥98%)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯 (EGCG，≥99%)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG，≥98%)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯 (ECG，≥98%)和咖啡因 (CAF，99.2%)等對(duì)照品購(gòu)自Aladdin Chemistry Co．Ltd。甲醇、乙酸為色譜純，購(gòu)自天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。乙腈為色譜純，購(gòu)自Fisher ChemAlert;超純水;酸性白土購(gòu)自遼寧省義縣石油白土廠。

1.3 儀器 MG08S-2B微波試驗(yàn)儀 (南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司);ML-902定時(shí)恒溫磁力攪拌器 (上海浦江分析儀器廠);N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海愛(ài)郎儀器有限公司);優(yōu)普超純水機(jī) (成都超純水科技有限公司);TDL5M臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī) (湘儀離心機(jī)儀器有限公司);LGJ-18S冷凍干燥機(jī) (北京松源華興科技發(fā)展有限公司);AW 320電子天平 (Shimdzu Corporation);Ultimate 3000戴安分析型高效液相色譜儀 (美國(guó)戴安公司);AP-01P真空泵 (天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

2 方法

2.1 茶多酚中咖啡因和兒茶素類(lèi)的測(cè)定 用高效液相色譜法 (HPLC)定量測(cè)定茶多酚中的咖啡因和兒茶素類(lèi)。測(cè)定條件如下:AT．Lichrom ODS色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);乙腈-乙酸-水 (9∶0.5∶90.5)為流動(dòng)相A，乙腈-乙酸-水 (80∶0.5∶19.5)為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min;柱溫35℃;檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。

表1 色譜條件

標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別稱(chēng)取沒(méi)食子酸3.0 mg、兒茶素10.0 mg、表兒茶素10.0 mg、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯30.0 mg、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯15.0 mg、表兒茶素沒(méi)食子酸酯25.0 mg和咖啡因5.0 mg至100 mL量瓶中，10%乙腈溶解后定容至刻度，配成沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和咖啡因的質(zhì)量濃度分別為30、100、100、300、150、250、50 mg/L的混合溶液，用0.45μm濾膜過(guò)濾，即得兒茶素類(lèi)和咖啡因的對(duì)照品混合溶液。移取1.0 mL兒茶素類(lèi)和咖啡因的對(duì)照品混合溶液，梯度稀釋至0、2、4、6、8、10倍。準(zhǔn)確吸取20μL兒茶素類(lèi)和咖啡因?qū)φ掌返幕旌先芤旱南♂屢?，在Ultimate 3000戴安分析型高效液相色譜儀上進(jìn)行檢測(cè)，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

測(cè)定茶多酚中咖啡因和兒茶素類(lèi)的量 精確稱(chēng)取0.01 g茶多酚于10 m L量瓶中，10%乙腈溶解后定容至刻度，用0.45μm濾膜過(guò)濾，即得茶多酚的樣品溶液。精密吸取20μL茶多酚的樣品溶液，在Ultimate 3000戴安分析型高效液相色譜儀上進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)得的色譜峰面積計(jì)算茶多酚中咖啡因和兒茶素類(lèi)的量。

2.2 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的技術(shù)路線 將茶葉用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱(chēng)取茶末6.0 g，加超純水120 mL，于MG08S-2B微波試驗(yàn)儀中80℃浸提60 min，微波輻照功率600 W［9］。對(duì)提取液立即進(jìn)行減壓抽濾，濾液即為茶多酚提取液。準(zhǔn)確量取100 mL茶多酚提取液，加入3.0 g酸性白土，120 r/min機(jī)械攪拌下吸附3次，每次40 min。吸附后的茶多酚提取液于TDL5M冷凍離心機(jī)上4 000 r/min離心10 min，上清液于N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，將濃縮液置于預(yù)先稱(chēng)定質(zhì)量的培養(yǎng)皿上，于LGJ-18S冷凍干燥機(jī)上干燥即可。稱(chēng)定培養(yǎng)皿質(zhì)量并計(jì)算茶多酚質(zhì)量，按2.1項(xiàng)中的方法測(cè)定咖啡因及兒茶素類(lèi)的量。

2.3 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn) 考察酸性白土用量、吸附時(shí)間、吸附次數(shù)和攪拌速率對(duì)酸性白土吸附茶多酚中咖啡因效果的影響。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:(1)酸性白土用量:酸性白土用量10、20、30、40、50 g/L，吸附時(shí)間20 min，吸附次數(shù)1次，攪拌速率120 r/min;(2)吸附時(shí)間:酸性白土用量30 g/L，吸附時(shí)間20、40、60、80、100 min，吸附次數(shù)1次，攪拌速率120 r/min;(3)吸附次數(shù):酸性白土用量30 g/L，吸附時(shí)間40 min，吸附次數(shù)1、2、3、4、5次，攪拌速率120 r/min;(4)攪拌速率:酸性白土用量30 g/L，吸附時(shí)間40 min，吸附次數(shù)3次，攪拌速率40、80、120、160、200 r/min;

2.3.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，因素及水平見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

2.4 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)數(shù)據(jù)平行3次實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)用SpssStatisticsV 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。采用最小顯著差異法 (LSD)對(duì)不同組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平α取0.05。

3 結(jié)果與討論

3.1 咖啡因和兒茶素類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線 兒茶素類(lèi)和咖啡因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

3.2 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝優(yōu)化

3.2.1 酸性白土用量對(duì)咖啡因吸附效果的影響 如圖1所示，當(dāng)酸性白土用量為10、20、30 g/L時(shí)，咖啡因量依次顯著降低 (P＜0.05)。當(dāng)酸性白土用量為30 g/L時(shí)，與40、50 g/L時(shí)相比，咖啡因量無(wú)顯著變化 (P＞0.05)，但茶多酚質(zhì)量卻顯著減小 (P＜0.05)，故選30 g/L為適宜的酸性白土用量。

3.2.2 吸附時(shí)間對(duì)咖啡因吸附效果的影響 如圖2所示，當(dāng)吸附時(shí)間為20、40 min時(shí)，咖啡因量依次顯著降低 (P＜0.05)。當(dāng)吸附時(shí)間為40 min時(shí)，與60、80 min時(shí)相比，咖啡因量無(wú)顯著變化 (P＞0.05)，茶多酚質(zhì)量卻顯著減小

圖1 酸性白土用量對(duì)咖啡因量和茶多酚質(zhì)量的影響(P＜0.05)，故選40 min為適宜的吸附時(shí)間。

圖2 吸附時(shí)間對(duì)咖啡因量和茶多酚質(zhì)量的影響

3.2.3 吸附次數(shù)對(duì)咖啡因吸附效果的影響 如圖3所示，當(dāng)吸附次數(shù)為1、2和3次時(shí)，咖啡因量依次顯著降低(P＜0.05);當(dāng)吸附次數(shù)為3次時(shí)，與4和5次相比，咖啡因量無(wú)顯著變化 (P＞0.05)，茶多酚質(zhì)量卻顯著減小 (P＜0.05)，故選3次為適宜的吸附次數(shù)。

圖3 吸附次數(shù)對(duì)咖啡因量和茶多酚質(zhì)量的影響

3.2.4 攪拌速率對(duì)咖啡因吸附效果的影響 如圖4所示，當(dāng)攪拌速率為40、80、120 r/min時(shí)，咖啡因量依次顯著降低 (P＜0.05)。當(dāng)攪拌速率為120 r/min時(shí)，與160、200 r/min時(shí)相比，咖啡因量無(wú)顯著變化 (P＞0.05)，茶多酚質(zhì)量亦無(wú)顯著變化 (P＞0.05)。故選120 r/min為適宜的攪拌速率。

3.2.5 酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的正交試驗(yàn) 為了更好地分析各個(gè)因素對(duì)茶多酚提取液中咖啡因脫除效果的影響，按表2的設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最經(jīng)濟(jì)最有效的工藝方案。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

圖4 攪拌速率對(duì)咖啡因和茶多酚質(zhì)量的影響

表4 吸附條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 正交試驗(yàn)方差分析

由表4可知，4個(gè)因素對(duì)咖啡因量影響作用的大小順序?yàn)镃＞A＞D＞B，即吸附次數(shù)＞酸性白土用量＞攪拌速率＞吸附時(shí)間，正交試驗(yàn)優(yōu)化的酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝條件為A3B2C3D3，即酸性白土用量40 g/L、吸附時(shí)間60 min、吸附次數(shù)3次和攪拌速率160 r/min。由表5可知，4個(gè)因素中只有吸附次數(shù)對(duì)咖啡因量影響顯著 (P＜0.05)。

單因素試驗(yàn)得到的最佳工藝條件為A2B1C3D2，正交試驗(yàn)得到的最佳工藝條件為A3B2C3D3，為驗(yàn)證可選方案，以未吸附組為對(duì)照，作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以比較這兩個(gè)方案的優(yōu)劣。結(jié)果表明，對(duì)照組、單因素優(yōu)化組和正交優(yōu)化組對(duì)應(yīng)的茶多酚質(zhì)量分別為 (1.121±0.004)g、(1.058±0.002)g和(1.021±0.002)g，咖啡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 (3.68±0.25)%、(0.06±0.01)%和 (0.04±0.01)%。單因素優(yōu)化組或正交優(yōu)化組與對(duì)照組相比，茶多酚質(zhì)量和咖啡因量均顯著減小或降低 (P＜0.05)，正交優(yōu)化組與單因素優(yōu)化組相比，咖啡因量無(wú)顯著變化 (P＞0.05)，茶多酚質(zhì)量卻顯著減小 (P＜0.05)。綜上，從經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、省時(shí)和高效的角度考慮，優(yōu)先選用單因素試驗(yàn)得到的最佳工藝條件A2B1C3D2。

3.3 酸性白土吸附咖啡因?qū)Σ瓒喾又懈鹘M分的影響 未吸附組和吸附組對(duì)應(yīng)的茶多酚的高效液相圖和咖啡因與兒茶素類(lèi)的量分別如圖5和表6所示。

圖5 對(duì)照品 (A)和脫咖啡因茶多酚 (B)的高效液相色譜圖

表6 脫咖啡因前后茶多酚組分的變化

結(jié)果表明，酸性白土對(duì)茶多酚中咖啡因的脫除效果十分顯著，未吸附組茶多酚中咖啡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 (3.68±0.25)%，而吸附組降為 (0.06±0.01)%，咖啡因脫除率達(dá)98.25%;未吸附組茶多酚中最主要的兒茶素類(lèi)是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，兒茶素類(lèi)的量由高到低依次是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、沒(méi)食子酸和兒茶素。吸附組茶多酚中兒茶素類(lèi)的量均有所提高，這是因?yàn)樗嵝园淄廖娇Х纫蚝?，咖啡因量的顯著降低引起了兒茶素類(lèi)相對(duì)含有量的提高，其提高次序由高到低依次是兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，酯型兒茶素表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和表兒茶素沒(méi)食子酸酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高了12.26%和8.23%;表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯為同分異構(gòu)體，未吸附組茶多酚中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的量之比為2.28，吸附組茶多酚中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的量之比為2.49，兩者之間無(wú)顯著差異 (P＞0.05)，說(shuō)明酸性白土脫除茶多酚中的咖啡因后，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯之間沒(méi)有發(fā)生明顯的同分異構(gòu)轉(zhuǎn)化。

王瑞芳等［10］研究表明，弱極性吸附樹(shù)脂RX-2對(duì)綠茶提取液中的咖啡因具有較高的吸附容量和吸附選擇性，動(dòng)態(tài)吸附時(shí)發(fā)生層析分離，是一種較為理想的咖啡因脫除劑，經(jīng)兩級(jí)樹(shù)脂純化后，咖啡因量降至0.2%以下。岳鵬翔等［11］對(duì)綠茶濃縮液中咖啡堿的超臨界CO2萃取工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，超臨界CO2萃取技術(shù)能有效地脫除綠茶濃縮液中的大部分咖啡因，咖啡因脫除率為84.26%。王平等［12］探討了活性炭吸附脫除茶葉提取液中咖啡因的最佳工藝條件，結(jié)果表明，在最優(yōu)條件下咖啡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)降為0.18%。與上述脫除咖啡因的方法相比，該法具有更高的咖啡因脫除率 (98.25%)，咖啡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)降為 (0.06±0.01)%，而且避免了有機(jī)溶劑殘留、設(shè)備投資高和工藝復(fù)雜等弊端。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)對(duì)酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，酸性白土吸附茶多酚中咖啡因的最佳工藝條件為酸性白土用量30 g/L、吸附時(shí)間40 min、吸附次數(shù)3次和攪拌速率120 r/min，這幾個(gè)因素對(duì)咖啡因量影響作用的大小順序?yàn)槲酱螖?shù)＞酸性白土用量＞攪拌速率＞吸附時(shí)間，且吸附次數(shù)對(duì)咖啡因量影響顯著 (P＜0.05)。此外，酸性白土吸附茶多酚中的咖啡因后，咖啡因量由 (3.68±0.25)%下降為 (0.06±0.01)%，咖啡因脫除率達(dá)98.25%，兒茶素類(lèi)活性物質(zhì)的量均有所提高，且表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯之間未發(fā)生明顯的同分異構(gòu)轉(zhuǎn)化。

綜上，酸性白土吸附法能夠有效地脫除茶多酚中的咖啡因，且與其它方法相比，茶多酚中咖啡因的脫除率更高，兒茶素類(lèi)活性物質(zhì)未有損失，且操作簡(jiǎn)便，成本低廉，安全無(wú)毒，省時(shí)高效，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，是一種值得推廣的方法。

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