空心蓮子草多糖定量測定比較

蔡凌云， 肖德智， 朱曉芳， 張曉鋒， 潘步恒， 肖恩杰， 李 燕

(1.凱里學院環境與生命科學學院，貴州凱里556011;2.西華師范大學生命科學學院，西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川南充637009)

空心蓮子草 Alternanthera philoxeroides(Mart．)Griseb，原產于巴西，又名革命草、水花生、喜旱蓮子草，為莧科Amaranthaceae蓮子草屬Alternanthera Forsk植物，1930年傳入中國，被列為中國首批外來入侵物，但具有藥用價值。性味甘寒無毒，具有清熱、涼血、解毒的功效。武漢市傳染病院，四川中草藥研究所，武漢醫學院微生物教研系等有關單位，對空心蓮子草進行了預防流感、防治流腦、臨床觀察及抑制病毒等研究實驗，發現對亞洲甲型流感病毒，乙腦和狂犬病毒、肝炎病及部分呼吸道病毒均有明顯的抑制作用［1-9］，我們前期研究表明空心蓮子草多糖抗氧化活性很強［10］，以其為原料開發生物活性多糖具有較大經濟價值，但空心蓮子草多糖定量測定尚未見報道。測定多糖量的方法很多，其中一類是利用多糖的還原性如3，5-二硝基水楊酸鹽 (DNS)比色法和Somogyi-Nelson法。另一類，即利用糖類在無機強酸條件中發生脫水反應生成醛類，并與酚類等物質縮合，生成特定的有顏色的物質，且有色物質的吸光值與多糖濃度成正比，如苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法［11］。在對照品的選用上目前也待考究。葡萄糖價格低廉和來源方便，得到廣泛應用。但比色法測定時，對照品與被測樣品的結構類似，結果更準確。如測粗多糖量時，對照品分別為葡萄糖和葡聚糖，前者測的結果不同程度的偏高，所以，用葡萄糖作為測定多糖量不是很合適［12-14］。基于這些實驗事實，人們開始逐漸改用葡聚糖作對照品為測定粗多糖量的，最為廣泛使用的是分子量為500 000的葡聚糖，故本實驗擬用葡聚糖 (T-500)作對照品研究空心蓮子草多糖量的測定方法，為確定空心蓮子草多糖定量測定方法和質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 空心蓮子草2011年6月采集于凱里學院實驗田邊，經生命科學學院周江菊教授鑒定為莧科蓮子草屬植物空心蓮子草Alternanthera philoxeroides(Mart．)Griseb。

葡聚糖 (T-500)德國Ruibio公司;其他實驗試劑均為分析純;實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備 瑞士BUCHIR-200旋轉蒸發儀;德國Eppendorf Research移液器;北京普析通用TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計;昆山KQ3200DE數控超聲清洗器;LD4-2低速離心機;ST841-3紅外線快速節能干燥箱;北京賽多利斯BT124S電子天平。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取與精制 準確稱取自然干燥的空心蓮子草粉末10 g，置于500 mL的錐形中加20倍蒸餾水，超聲提取20 min，功率100%，溫度40℃，冷卻，減壓過濾，殘渣按第一次操作步驟重復一次。合并提取液，減壓濃縮。用savage法反復除去蛋白，加入100%乙醇，放置于4℃冰箱冷藏過夜，然后在4 000 r/min離心10 min，棄上清液，殘渣用乙醇洗滌后用水溶解后定容于50 mL量瓶中，加入100 mL 100 g/L氫氧化鈉溶液、100 mL 100 g/L銅試劑溶液，沸水浴中煮沸2 min，冷卻，4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，殘渣用洗滌液洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣供測定多糖量用。

1.3.2 對照品溶液的制備 準確稱取50 mg葡聚糖對照品(105℃干燥至恒定質量)，用蒸餾水溶解并定容250 mL，得0.2 mg/mL的葡聚糖對照品液。

1.3.3 多糖測定 葡聚糖為對照品，采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，分別測定吸光度。

1.3.4 檢測波長的確定

1.3.4.1 苯酚-硫酸法 分別取對照品和樣品溶液各1 mL，各加蒸餾水使其均達到2 mL，并以2 mL蒸餾水做空白對照，分別加入4 mL苯酚溶液和10 mL濃硫酸，在沸水浴中加熱5 min顯色，立即用流動的冷水沖洗使其冷卻，在300～600 nm掃描，測定其最大吸光值。

1.3.4.2 蒽酮-硫酸法 取對照品和樣品溶液各1mL，分別加蒸餾水使均達到2 mL。冰水浴處理5 min，再分別加入新配制蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，沸水浴加熱20 min，自來水冷卻至室溫，在300～600 nm掃描，測定其最大吸光值。

1.3.5 標準曲線的繪制 準確吸取對照品0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，按1.3.4項下方法分別測定吸光度，以吸光值A為縱坐標，葡聚糖質量濃度C為橫坐標分別繪制苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的標準曲線，得回歸方程。

1.3.6 精密度試驗 精密吸取樣品溶液6份，按1.3.4項下方法分別測定吸光度，計算RSD。

1.3.7 穩定性試驗 精密吸取樣品溶液，在1 h內，每隔10 min按1.3.4項下方法分別測定吸光度，計算RSD。

1.3.8 加樣回收實驗 精密吸取樣品溶液6份，分別加入標準溶液，按1.3.4項下方法測定多糖量，計算RSD。

1.3.9 空心蓮子草粉多糖量的測定 精密吸取樣品溶液1 m L，按1.3.4項下方法操作，測定其吸光值 (3個平行)，代入回歸方程計算樣品溶液中葡聚糖平均質量濃度C。按照下式計算多糖質量分數 (單位mg/g):

多糖量 =CD/W

式中，C為1 mL樣品溶液中葡聚糖的質量濃度 (mg/mL);D為多糖的稀釋因素;W為稱取樣品的質量 (g)。

2 實驗結果

2.1 波長確定 苯酚-硫酸法樣品和對照品在446 nm處都有最大吸收，故實驗時在446 nm處測定其吸光值。蒽酮-硫酸法樣品和對照品在波長626nm處都有最大吸收，故實驗時在626 nm處測定其吸光值。

2.2 標準曲線繪制 標準曲線 (苯酚-硫酸)的回歸方程為A=30.457C+0.001 1，相關系數 r=0.999 5，在0～0.019 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。標準曲線 (蒽酮-硫酸)的回歸方程為A=10.505C+0.003 6，相關系數r=0.998 3，在0～0.04 mg/m L范圍內呈良好的線性關系。

2.3 精密度、穩定性、回收率試驗結果。見表1～3。

表1 精密度實驗結果

表2 穩定性實驗結果

4 結論與討論

本實驗用超聲輔助提取空心蓮子草中的多糖類化合物，用堿性二價銅選擇性地從其他高分子物質中沉淀出具有葡聚糖結構的多糖，沉淀部分與苯酚-硫酸或蒽酮-硫酸反應，生成有色物質，在446 nm和626 nm條件下，有色物質的吸光度值與葡聚糖質量濃度存在定量關系。反應迅速完全，有色物質穩定。以葡聚糖為對照品，用苯酚-硫酸法 (446 nm)測出空心蓮子草多糖的質量分數3.95 mg/g，用蒽酮-硫酸法 (626 nm)測出空心蓮子草多糖的質量分數為4.46 mg/g。具體見表4。蒽酮-硫酸法測定結果較苯酚-硫酸法偏高。蒽酮-硫酸法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，所以用蒽酮-硫酸法測出的碳水化合物量實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。因此，蒽酮-硫酸法測定結果高于苯酚-硫酸法。實驗結果顯示苯酚-硫酸法，結果更穩定、準確，可將其作為空心蓮子草多糖定量測定的有效方法。

表3 加樣回收率實驗結果

表4 多糖量的測定結果

葡聚糖是多糖中的一類，被認為是最具生理活性的一種多糖，所以衛生部要求多糖量的標準應以葡聚糖計量。我們首次以葡聚糖為對照品，測定空心蓮子草多糖量，研究結果顯示空心蓮子草多糖量豐富，為空心蓮子草多糖的開發提供了依據，但對空心蓮子草多糖的定性分析和結構組成，有待進一步的研究。

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