沙利度胺抑制小鼠T淋巴瘤的實(shí)驗(yàn)研究

吳廣銀 張 辰 王莉莉 姚志華 張明智

1.河南省人民醫(yī)院腫瘤放療科，河南鄭州 450003；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州 450052；3.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州 450003

惡性淋巴瘤在我國雖然發(fā)病率不高，但惡性程度高，預(yù)后較差，特別是T細(xì)胞淋巴瘤經(jīng)綜合治療5年生存率僅為30%[1]。沙利度胺（反應(yīng)停，酞咪哌啶酮，Thalidomide）因?qū)е绿夯斡?0世紀(jì)60年代被禁用。1994年以來研究發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，抑制腫瘤血管生成等作用而用于多種腫瘤的治療[2]。本文觀察了沙利度胺對小鼠移植性T淋巴瘤的抑制作用，為其更好地應(yīng)用于臨床提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動物

BALB/C 純系雌性小鼠，體重 18～22 g，6～8 周齡，購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心。EL-4細(xì)胞（鼠T淋巴瘤白血病細(xì)胞株）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。

1.2 藥品、試劑、儀器

沙利度胺由常州制藥廠生產(chǎn)，批號：0508241。原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（POD），購自華美生物工程公司。TNF-α引物由上海生工生物有限公司合成，上游引物序列：5'-AGT CCG GGC AGG TCT ACT TT-3'， 下游引物：5'-GCA CCT CAG GGA AGA GTC TG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為422 bp。β-actin上游引物序列：5'-CCA GAG CAA GAG AGG TAT CC-3'，下游引物序列：5'-GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為276 bp。Trizol購于invitrogen公司，rTag酶購于TaKaRa公司。

2 方法

2.1 模型的建立

EL-4細(xì)胞懸浮生長于含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2。選生長對數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，無菌生理鹽水調(diào)細(xì)胞濃度為5×106個/mL。取懸液0.2 mL接種于32只BALB/C小鼠右腋部皮下。

2.2 抑瘤率實(shí)驗(yàn)

接種后第2天，將32只小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。①陰性對照組：小鼠 8只，生理鹽水灌胃 25 mL/（kg·d）共14 d；②低劑量組：小鼠 8 只，沙利度胺灌胃 50 mg/（kg·d）共14 d；③中劑量組：小鼠 8 只，沙利度胺灌胃 200 mg/（kg·d）共 14 d；④高劑量組：小鼠 8 只，沙利度胺灌胃 400 mg/（kg·d）共14 d。觀察小鼠體重，并用游標(biāo)卡尺測腫瘤直徑，計(jì)算腫瘤體積。于用藥后第15天處死小鼠，分離腫瘤，計(jì)算抑瘤率。第2批32只小鼠同樣方法建立模型分組記錄平均生存期。公式：瘤體積=ab2/2（a為腫瘤最長徑，b為腫瘤最短徑）；抑瘤率=（對照組瘤重-給藥組瘤重）/對照組瘤重×100%。

2.3 HE染色

將石蠟切片，常規(guī)脫蠟、乙醇梯度脫水，蘇木素-伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2.4 TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡

取腫瘤組織，10%福爾馬林固定24 h，脫水包埋，4 μm連續(xù)切片，按試劑盒說明操作。顯微鏡下觀察：以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）：凋亡細(xì)胞占全部腫瘤細(xì)胞的比例，在高倍鏡下計(jì)數(shù)每100個腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，每例至少計(jì)數(shù)1000個腫瘤細(xì)胞，取其平均數(shù)。

2.5 RT-PCR法檢測TNF-α mRNA的表達(dá)

2.5.1 常規(guī)提取腫瘤組織RNA用TaKaRa公司cDNA第一鏈合成試劑盒（First Strand cDNA synthesis kit）合成cDNA第一鏈，參照說明書操作。

2.5.2 25μL PCR 擴(kuò)增體系 DDH2O 14.5μL，10×PCR buffer 2.5 μL，β-actin上、下游引物各1μL，TNF-α上、下游引物各1μL，cDNA 1μL，dNTP 2μL，Taq 酶1μL。

2.5.3 PCR擴(kuò)增條件 預(yù)變性：94℃ 2 min，變性：94℃ 30 s，退火溫度 55.6℃，退火時(shí)間 30 s，72℃延伸 1 min，進(jìn)行 30個循環(huán)后，再72℃繼續(xù)延伸5 min，置4℃保存。

2.5.4 電泳 1%瓊脂糖電泳，5 V/cm，電泳時(shí)間20 min，觀察PCR產(chǎn)物，照像，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析光密度，計(jì)算表達(dá)量。公式：TNF-α mRNA相對表達(dá)量=擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值TNF-α/擴(kuò)增產(chǎn)物光密度值β-actin×100%。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 沙利度胺對荷瘤小鼠的抑瘤作用

沙利度胺各組瘤重與對照組相比減小，低、中、高劑量組抑瘤率分別為：17.75%，36.73%，42.04%。各組平均生存期較陰性對照組延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組比較，低劑量組與中高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），中高劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

表1 沙利度胺對荷瘤小鼠的抑瘤作用（±s）

表1 沙利度胺對荷瘤小鼠的抑瘤作用（±s）

注：與給藥前體重比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05

陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組22.5±2.6 27.8±4.2*29.7±3.7*▲25.9±3.8*▲20.66±2.03 21.08±1.33 20.90±0.84 20.68±2.14 22.43±1.96a 22.76±1.85a 22.19±2.02a 21.31±1.66 0.5426±0.1801 0.4482±0.1278 0.3462±0.1587 0.3021±0.1749 0.00 17.75*36.73*▲42.04*▲組別 生存期（d）瘤重（g）抑瘤率（%）體重（g）給藥前 給藥后

3.2 HE染色結(jié)果

鏡下見組織異形性明顯，可見核分裂相，判斷為惡性腫瘤組織，腫瘤細(xì)胞呈彌漫性生長。沙利度胺各組腫瘤組織有不同程度的壞死，腫瘤細(xì)胞稀疏，大小不一。以中劑量為例，見圖1。

圖1 鼠EL-4移植瘤腫瘤組織（HE染色，400×）

3.3 TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒可將處于不同階段的凋亡細(xì)胞DAB顯色后顯示出來，本實(shí)驗(yàn)中沙利度胺各組小鼠腫瘤組織中散在分布著孤立的細(xì)胞核黃染或有棕黃色顆粒的細(xì)胞即凋亡細(xì)胞，其中，中高劑量組AI明顯高于陰性對照組（P<0.05）（圖2、表2）。

表2 中高劑量組凋亡指數(shù)結(jié)果（±s）

表2 中高劑量組凋亡指數(shù)結(jié)果（±s）

注：與陰性對照組比較，*P<0.05

陰性對照組中劑量組高劑量組2.31±0.94 9.23±1.56*10.86±1.73*組別 凋亡指數(shù)

3.4 RT-PCR法檢測TNF-α mRNA結(jié)果

以β-actin做內(nèi)參照，圖像分析得出各組移植瘤組織中TNF-α mRNA相對表達(dá)量，可見沙利度胺各劑量組腫瘤組織中TNF-α mRNA表達(dá)水平低于陰性對照組腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、表3。

4 討論

圖2 TUNEL法檢測小鼠腫瘤組織凋亡（SP，400×）

表3 各組TNF-α mRNA表達(dá)結(jié)果（±s）

表3 各組TNF-α mRNA表達(dá)結(jié)果（±s）

注：與陰性對照組比較，*P<0.05

陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組8888 0.871±0.194 0.732±0.113*0.523±0.056*0.474±0.173*組別 只數(shù) TNF-α mRNA表達(dá)

圖3 各組小鼠腫瘤組織TNF-α mRNA表達(dá)

沙利度胺是一個谷氨酸衍生物，化學(xué)名稱是N-（2，6二氧-3-哌啶基）-鄰苯二甲酰亞胺。目前臨床用于治療多發(fā)性骨髓瘤，腎癌等取得一定療效[3]，但有關(guān)治療淋巴瘤報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)中荷瘤鼠口服沙利度胺50～400 mg/kg，移植瘤體積縮小，抑瘤率分別是17.75%，36.73%，42.04%，各組小鼠生存時(shí)間明顯延長，較對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。即提示沙利度胺有直接抑制T細(xì)胞淋巴瘤的作用，與Beckers等[4]報(bào)道一致。

目前認(rèn)為，腫瘤的發(fā)病與細(xì)胞凋亡的失衡直接相關(guān)。孫萍等[5]報(bào)道沙利度胺有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)中TUNEL法檢測腫瘤凋亡，鏡下觀察，治療組可見腫瘤細(xì)胞凋亡，形成凋亡小體，凋亡小體被周圍吞噬細(xì)胞吞噬、降解。腫瘤組織有輕度白胞浸潤和局灶性壞死。中高劑量組癌細(xì)胞AI明顯高于對照組，提示沙利度胺通過誘導(dǎo)T淋巴瘤細(xì)胞凋亡起到抑制腫瘤生長的作用。

TNF-α具有介導(dǎo)炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用，其效應(yīng)包括激活淋巴細(xì)胞、釋放其他細(xì)胞因子（如IL-1、IL-6）、前列腺素和金屬蛋白酶；也可以促進(jìn)血管形成和調(diào)節(jié)黏附分子作用。Majumder等[6]報(bào)道沙利度胺可以通過下調(diào)TNF-α的表達(dá)，從而抑制下游因子分泌，起到抑制腫瘤的作用。本實(shí)驗(yàn)中RT-PCR法檢測移植瘤組織的TNF-α mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沙利度胺處理組腫瘤組織TNF-α mRNA表達(dá)下降，較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示沙利度胺抑制T細(xì)胞淋巴瘤的機(jī)制之一是降低TNF-α的表達(dá)。

總之，文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]沙利度胺抗腫瘤機(jī)制復(fù)雜，可能與抑制微血管的生成，減少TNF-α的合成，降低IL-6的產(chǎn)生，抑制整合素的表達(dá)等有關(guān)。近年來，沙利度胺在臨床研究中取得了更肯定的療效：顧愛琴等[9]報(bào)道，沙利度胺聯(lián)合NP方案化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌可以提高化療療效，延長中位生存期，減輕化療引起的嘔吐反應(yīng)。劉金等[10]研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺聯(lián)合同步放化療治療小細(xì)胞肺癌有增加放療敏感性，提高局部控制率的作用。因此，對其衍生物——來那度胺的研究也成為熱點(diǎn)。Zinzani等[11]報(bào)道來那度胺聯(lián)合利妥昔單抗治療復(fù)發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤可以提高療效。Zabransky等[12]的研究表明來那度胺對前列腺癌的治療有確切療效。在多發(fā)性骨髓瘤等血液病的研究中，Mc-Carthy等[13]報(bào)道來那度胺對骨髓移植后的患者維持治療，可以降低復(fù)發(fā)，延長生存期。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙利度胺可能通過誘導(dǎo)T淋巴瘤細(xì)胞的凋亡、抑制TNF-α的表達(dá)而發(fā)揮雙重抗腫瘤生長的作用，沙利度胺及其衍生物因其價(jià)格低廉，服用方便，副反應(yīng)少，有望成為治療淋巴瘤的有效藥物，但尚需要臨床進(jìn)一步研究證實(shí)。

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