HPLC-ELSD 法測定八角茴香中莽草酸的含量

唐 霖 裴利霞

1.浙江醫藥高等專科學校，浙江寧波 315100；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院中藥藥理實驗室，上海 200032

八角茴香，常綠喬木，高達20 m。其聚合果含大量莽草酸，常由8個骨突果生在中軸呈星狀，外表面紅棕色，有不規則皺紋，頂端呈鳥喙狀，上側多開裂[1]。主產廣西、廣東、云南等地[2]。莽草酸是從中藥八角茴香中提取的一種單體化合物，有抗炎、鎮痛作用，是抗癌藥物中間體。有明顯抗血栓形成作用，可抑制動、靜脈血栓及腦血栓形成[3]。莽草酸是世界上對付禽流感的唯一武器，莽草酸是可有效對付致命的H5N1禽流感病毒的藥物“達菲”的重要成分。

莽草酸（shikimic acid）為三萜酸，結構式見圖1。它是有機弱酸，在水溶液中易解離?，F有的HPLC 分析檢測方法主要有以下幾種：①直接用ODS 柱測定，結果發現莽草酸不經吸附就可直接出峰。為了在常規的ODS 柱上延長莽草酸的保留時間，一般要加入磷酸緩沖鹽溶液[4]，或強酸溶液（HClO4，pH=2.5）[5-6]，或離子對試劑[7]。但是，磷酸鹽緩沖液系統和強酸溶液會增加對反相色譜柱損壞的程度。②采用氨基鍵合相硅膠柱[8]，不需要加入強酸做流動相，即可獲得令人滿意的分離效果。③在檢測波長的選擇方面，現有文獻均用213 nm 左右的波長進行測定，但是該吸收峰接近末端吸收，易受雜質干擾。相比之下，蒸發光散射檢測器（evaporative light-scattering detector，ELSD）由于其獨特的檢測原理卻可以克服紫外檢測器的不足，這是因為ELSD 檢測器適用于分析沒有紫外吸收或者只有末端吸收的成分，其響應不依賴于樣品的光學特性，任何揮發性低于流動相的樣品均能被檢測。ELSD 的響應值與樣品的質量成正比，因而能用于測定樣品的純度或者檢測未知物。因此，為了提高莽草酸含量測定的準確性，本文選擇了氨基鍵合相硅膠柱和蒸發光散射檢測器進行含量測定研究。

圖1 莽草酸的結構式

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC，Alltech 2000 型蒸發光散射檢測器；色譜柱：Hypersil NH2柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），大連伊利特。

莽草酸標準品（蕪湖甙爾塔醫藥科技有限公司，純度98%）；八角茴香藥材購于廣西并由浙江醫藥高等?？茖W校王和平教授鑒定為八角茴香Illicium verum Hook.F.。乙腈為色譜純（Fisher 公司），甲酸（分析純），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 標準品溶液的制備

精密稱取莽草酸28.5 mg，用甲醇溶于25 mL 量瓶中，定容至刻度，搖勻，作為莽草酸標準儲備液。精密量取儲備液5 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為莽草酸的標準品溶液，濃度為0.57 mg/min。

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過3 號篩）0.5 g，精密稱定置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定質量；超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）40 min，室溫放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻。以0.45 μm 濾膜過濾，取濾液，即得。

2.3 含量測定

2.3.1 液相條件 柱溫：30℃，流動相：乙腈-水（80∶20，均含0.1%甲酸），流速1.0 mL/min，漂移管溫度100℃，載氣流速2.5 L/min。進樣量10 μL。標準品和樣品色譜分離見圖2、3。

圖2 莽草酸標準品高效液相色譜

圖3 樣品高效液相色譜

2.3.2 標準曲線繪制 取上述莽草酸標準品溶液（0.57 mg/mL），然后按“2.3.1”項下色譜條件，分別精密吸取 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL 注入液相色譜儀，分析并記錄結果（色譜峰面積）。以標準品進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積A 為縱坐標（Y），進行線性回歸，得莽草酸回歸方程及相關系數如下：Y=550.797 6X+72.557 9，r=0.999 9。結果表明，莽草酸進樣量在0.57～11.40 μg 范圍內線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 取莽草酸標準品溶液 （0.57 mg/mL），重復進樣5 次，每次10 μL，記錄色譜峰面積，RSD 為1.26%。

2.3.4 重復性試驗 取同一批八角茴香藥材，按“2.2”項下方法，重復5 次取樣制備供試品溶液，按“2.3.2”項下方法測定并計算含量，莽草酸含量的RSD 為1.79%。

2.3.5 回收率試驗 取已知含量（5.84%）的同一批八角茴香藥材，精密稱取5 份，每份約0.05 g，分別精密加入莽草酸對照品溶液（1.14 mg/mL）3 mL，然后按“2.3.2”項下方法測定含量，并計算回收率，具體結果見表1。

表1 樣品回收率測定結果（n=6）

2.3.6 穩定性試驗 稱取八角茴香樣品0.5 g，按“2.2”項下方法處理，得供試品溶液，分別于 0、2、4、6、10、16、24 h 測定莽草酸含量，記錄相應峰面積，計算5 次進樣測得峰面積的RSD 值。結果莽草酸峰面積的RSD 為1.43%，表明供試品溶液在24 h 內基本保持穩定。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本實驗對ODS 柱和NH2 柱的分離效果進行了比較。直接用ODS 柱測定，發現莽草酸不經吸附就直接出峰。考慮到這可能是由于莽草酸的電離引起的，而在NH2柱上莽草酸可以獲得較好的分離。

3.2 流動相的酸度

發現流動相的酸度對莽草酸的保留時間有較大影響，流動相（含0.1%甲酸）室溫放置2 d 后，莽草酸的保留時間明顯延后（從9 min 延長到12 min）。因此提示流動相要臨用現配。

3.3 檢測器的選擇

通過對莽草酸現有檢測方法的考察，發現常規紫外檢測中存在著末端吸收的問題，為了避免該問題，本文選擇了更具通用性的蒸發光散射檢測器，該方法具有簡便快速、結果準確、重現性好的特點。

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