甲磺酸加貝酯在小腸缺血－再灌注損傷中的預防作用

王 健，劉振芬

(四川省隆昌縣人民醫院藥劑科，四川 內江 642150)

缺血－再灌注(I/R)，損傷是臨床實踐中最常見的組織器官損傷的病因之一，涉及氧自由基的產生，損傷區炎性細胞浸潤等多因素、多階段復雜的病理生理過程。腸I/R損傷引起消化道局部組織的損害可誘發腸內細菌移位、大量毒素進入體循環，引起炎性介質與細胞因子釋放從而導致全身炎性反應、多器官功能衰竭(MODS)甚至死亡[1]。近年來，根據I/R損傷的發生機制采用缺血預處理，低溫低流量再灌注，抑制、清除氧自由基氧的產生，抗白細胞聚集黏附等治療方法來減輕I/R后損傷[2]。然而，迄今尚無一種特效方法能徹底解決這一醫學難題。甲磺酸加貝酯是一種非肽類蛋白酶抑制劑，可抑制胰蛋白酶、激肽釋放酶、纖維蛋白溶酶、凝血酶等多種蛋白酶的活性，抑制炎癥介質的釋放，從而減輕炎性反應。本試驗運用兔腸I/R模型，頸外靜脈應用甲磺酸加貝酯治療，觀察其在腸I/R損傷中的保護作用，旨在探求防治腸I/R損傷的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新西蘭白兔60只，體重(2.0±0.3)kg，均購于瀘州醫學院實驗動物中心，雌雄不限，隨機分為假手術組、對照組、腸I/R組和藥物治療組，每組15只。甲磺酸加貝酯注射液由四川陽光潤禾藥業有限公司提供，規格為100mg/支的水溶液。

1.2 方法

標準飼料適應性喂養2周。手術前12 h開始禁食，不禁水，腹腔注射2%硫噴妥鈉3mL/kg麻醉后，取右側臥位，固定于手術臺上。右腹股溝區、左腹部備皮、消毒，切開分離出右股動脈，插管，接三通管并連接含有肝素的0.9%氯化鈉注射液(肝素0.01 g/L)5mL注射器上(供抽血用)。手術分離腸系膜上動脈(SMA)后，用無損傷血管夾夾閉其根部，1 h后松夾再灌注，關閉切口，術后按試驗組分籠飼養。

1.3 動物試驗模型制作

將動物隨機分成4組，每組15只。模型組:將動物進行上述操作，動脈夾夾閉SMA 1 h松夾;藥物治療組:操作同模型組，在夾閉SMA 30min后經頸外靜脈脈注射甲磺酸加貝酯30mg/kg;假手術組:動物進行上述操作，但不夾閉SMA;正常組:不進行手術，正常飼養，麻醉后立即取標本。其余組再灌注6 h后采集門、體靜脈血，行左肺灌洗并收集支氣管－肺泡灌洗液(BALF)，取右肺、肝及小腸組織。

1.4 觀察指標與方法

取回盲部近端約16 cm處腸管4 cm，常規石蠟包埋，切片后HE染色;應用OLYMPASBX－50多功能顯微鏡，觀察不同視野并選片照相。運用顯微圖像分析系統(VIDAS)隨機選出每張切片上黏膜內的3個視野進行圖像分析，測其平均吸光度值(A值)。腸組織病理分級遵照Chiu等[3]的標準，按照雙盲法原則進行。BALF中蛋白含量采用磺基水楊酸透射比濁法測定;門、體靜脈血內毒素采用偶氮顯色法測定，試劑盒由北京醫學化驗所提供;肺組織中髓過氧化酶(MPO)含量測定參考Krawisz等[4]的方法。放血處死動物后迅速開胸整塊取出肺、肝及小腸組織，立即以0.9%氯化鈉注射液進行勻速灌洗;取8～12 g肺組織，加入80mL含0.5%十六烷基三甲基溴化胺的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.4)，用超聲細胞粉碎機將其治成組織均漿，離心15min，取20mL上清液加0.3%過氧化氯溶液1.8mL、100mmol/L 4磷酸鉀緩沖液30mL及0.041mol/L二茴香胺溶液20mL;用724型分光光度計在460 nm波長處測定1～3min時 A值變化值，按照公式MPO活性=△A460×13.5/肺重量(g)計算每克濕肺組織的MPO活性。以每10個高倍視野中中性粒細胞(PMN)的數目測定肝組織病理切片中PMN浸潤程度。

1.5 統計學處理

計量資料的比較采 t檢驗或方差分析，等級資料的比較采用秩和檢驗，取 α =0.05。

2 結果

試驗結果顯示，正常組與假手術組絨毛上皮細胞排列規整，腸壁組織均勻。模型組可見腸上皮細胞明顯水腫，壁變薄，小腸絨毛短細間距變寬;部分上皮細胞壞死脫落，腸黏膜固有層內腺體可見灶性區域壞死及淋巴細胞、中性粒細胞浸潤;模型組腸病理分級明顯高于假手術組(P＜0.05)和正常組(P＜0.01)，見表 1。腸I/R損傷致多器官損傷指標比較見表2。腸I/R對組織中PMN的影響見表3。

表1 各組兔腸的病理分級(只，n=5)

3 討論

小腸黏膜是迄今發現I/R損傷最敏感的臟器之一，腸I/R是應激狀態中必經的病理生理過程。目前認為，腸黏膜低灌注、氧自由基損傷及細胞因子作用是腸黏膜三大主要致傷因素[5]。黃嘌呤氧化酶形成增多、中性粒細胞的呼吸爆發、線粒體功能受損、兒茶酚胺自身氧化增加等而導致部分動物或患者細胞功能代謝障礙及腸上皮細胞壞死、微絨毛分離及固有層崩解[6]。另外，腸道屏障破壞后細菌移位，細菌毒素入血后而導致時空性炎性反應和毒血癥[7]，其誘發的MODS和膿毒癥的研究一直是國內外的熱點、難點，但目前尚缺乏對缺血后腸黏膜局部炎癥損害和全身炎性反應無針對性的治療藥物。

表2 腸I/R致多器官損傷各組指標比較(±s)

表2 腸I/R致多器官損傷各組指標比較(±s)

注:與正常組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01;與模型組相比較，＊P＜0.05，#P＜0.01;與假手術組相比，□P ＜0.05，■ P ＜0.05。下表同。

組別正常組假手術組模型組藥物治療組門靜脈內毒素(pg/mL)4.42 ±0.92 6.04 ±0.88 17.79 ±4012▲□10.18 ±1.66△體靜脈內毒素(pg/mL)3.81 ± 1.22 4.23 ± 1.08 14.02 ± 1.70△■7.13 ± 1.45△BALF蛋白(10×mg/L)81.745 ±0.158 10.645 ±1.179▲19.167 ±1.590■10.268 ±1.931▲#血清GPT(U/L)45.188 ±3.793 201.668 ±11.547▲153.912 ±12.146▲101.801 ±10.971△＊

表3 腸I/R對組織中PMN的影響(±s)

表3 腸I/R對組織中PMN的影響(±s)

組別正常組假手術組模型組藥物治療組肝PMN(個/10HPF)11.666 ± 1.567 14.201 ± 1.617 35.121 ± 3.337■19.068 ± 2.731△#腸MPO(A/g)0.003 ± 0.002 0.005 ± 0.001 0.164 ± 0.030▲□0.068 ± 0.016▲#肺MPO(A/g)0.153 ± 0.041 0.796 ± 0.160▲1.266 ± 0.181■0.580 ± 0.083▲#

本研究中觀察了靜脈給予甲磺酸加貝酯對腸I/R損傷后的全身炎性反應及多器官功能障礙的影響，結果表明，在腸缺血早期腸內給予甲磺酸加貝酯能多靶點干預腸I/R損傷的基本病理環節，增加腸黏膜血流量，降低血漿腫瘤壞死固子α(TNF－α)的水平，抑制PMN活化、聚集，減輕肝、肺、小腸及腸系膜淋巴結炎性細胞浸潤及組織損傷，從而減輕炎性反應，對于防治腸I/R損傷和MODS具有潛在臨床應用價值。PMN活化可與內皮細胞的黏附從而促進氧自由基及溶酶體酶釋放造成組織損傷，是引起MODS的共同原因之一;PMN與內皮細胞的黏附還能造成微循環障礙，組織器官內皮細胞水腫，阻礙血紅蛋白向組織細胞釋放氧，進一步加重組織損傷。在本研究中發現，腸I/R中肝、肺等遠端組織器官均可見PMN等炎癥細胞浸潤增加，提示PMN在腸I/R以及所致的全身炎性反應及MODS中有重要作用，抑制PMN的活性有望成為治療和預防I/R的新的潛在靶點。

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