姜露散對大鼠感染性創面提膿祛腐的作用及機制

王佳雯 陸金根 曹永清 潘一濱

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院肛腸科，上海，200032)

升丹是目前臨床應用的主要提膿祛腐藥物。但近年臨床和動物實驗均表明潰瘍創面應用升丹都會有不同程度的汞吸收，其毒性有蓄積性，可對內臟等造成損害，甚至可以引起中毒致死。其他類提膿祛腐藥物大多數也是有毒性的藥物。因此，尋求高效、無毒的升丹替代品無疑成為中醫外科工作者迫在眉睫的任務［1－3］。上海中醫藥大學附屬龍華醫院陸金根教授通過對古代醫籍和現代文獻的回顧性理論研究［4－19］，并結合中醫外科多年的臨床用藥經驗，擬方姜露散。本研究通過動物實驗，觀察該方對感染性創面提膿祛腐的作用，并探討其作用的可能機制及用藥安全性，為中藥提膿祛腐藥物提供高效、無毒的升丹替代品。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠72只，SPF級，體質量200～220 g/只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，飼養于上海中醫藥大學附屬龍華醫院科研中心。

1.2 藥物 姜露散由上海中醫藥大學附屬龍華醫院制劑室制備。九一丹由上海華鷹藥業有限公司提供。

1.3 細菌 采用上海市臨床檢驗中心提供的大腸埃希菌標準菌株(ATCC 25922)，配制成濃度為5億菌株/mL的大腸埃希菌混懸液。

1.4 主要試劑與儀器 溶酶體抗體(美國Santa Cru)、EnVision 試劑即用型(丹麥 Dako)、3＇3 － 二氨基聯苯胺鹽酸鹽(DAB)顯色液試劑盒(武漢博士德)、大鼠IL－1β定量ELISA試劑盒(美國RD);生物顯微鏡(Olympus BH2)、數碼相機(Nikon E4500)、紫光分光光度計(日本Beckman Du－600)、全自動生化檢測分析儀(OLYMPUS AU460)。

1.5 方法

1.5.1 分組、造模與給藥 參照上海中醫藥大學附屬曙光醫院張雅明［20］以及南京市中醫院鄭雪平［21］等造模方法，并改良付小兵［22－23］全層皮膚缺損法建立大鼠感染性創面模型。在麻醉后的大鼠頸背部作一直徑2 cm的圓形切口，深達肌筋膜，破壞部分肌肉表面筋膜，止血后在創面上覆蓋大小相仿的紗布，紗布中浸入新培養的大腸埃希菌標準菌株1 mL(約5億菌株)。3 d后，創口表面附有膿性分泌物，周圍皮溫略升高，感染性創面模型造模成功。將大鼠隨機分為三組:姜露散組、九一丹組、模型組，每組24只。造模各組大鼠每天分別給予姜露散、九一丹創面換藥，模型組給予生理鹽水創面換藥，1次/d，連續治療14 d。

1.5.2 觀察大鼠一般情況 包括精神狀態、活動情況、進食量、大小便情況。

1.5.3 創面膿腐脫落時間 從用藥開始到膿腐脫落的時間(通過創面色澤的變化判斷，即當創面變為鮮紅色，見到肉芽組織為止)。

1.5.4 創面分泌物量 第3、7、14 d，無明顯分泌物，計0分;分泌物量少，用一根消毒棉簽可以吸凈，計1分;分泌物量較多，用二根消毒棉簽可以吸凈，計2分;分泌物量大，用二根以上消毒棉簽可以吸凈，計3分。

1.5.5 免疫組化EnVision法檢測創面肉芽組織中溶菌酶含量 第3、7、14 d，各組隨機處死8只大鼠，取近創緣約0.5 cm×0.5 cm的肉芽組織，按免疫組化試劑盒操作說明進行。對每張免疫組化片高倍鏡下(×250)隨機取3個視野窗，在OLYMPUS 1X70倒置熒光圖像采集分析系統上利用Imge－Pro Plus分析軟件，將陽性細胞用像素點表示并換算成μm2，采用Imagepro－plus圖像分析系統分析軟件，以陽性反映細胞總面積代表陽性反應細胞數，結果取均值。

1.5.6 雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測創面肉芽組織中IL－1β含量 第3、7、14 d，各組隨機處死8只大鼠，取近創緣約100 mg的肉芽組織，按大鼠IL－1β定量ELISA試劑盒操作說明進行。以標準品不同稀釋濃度為橫坐標，光學密度值(optical density，OD)為縱坐標作標準曲線圖，根據樣品OD值查出相應IL－1β含量。

1.5.7 酶法檢測主要肝腎功能指標 第7、14 d，各組隨機處死8只大鼠，腹主動脈采血。將取得的血清置于全自動生化檢測分析儀中，直接讀取血清BUN，CREA，ALT值。

1.5.8 統計學方法 采用SPSS 12.0軟件進行數據處理及分析，實驗數據以(s)表示，方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett＇s T3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 造模成功后各組動物都呈病態，皮毛雜亂，倦縮少動，攝食量、攝水量明顯減少。

表1 各組創面膿腐脫落時間比較(d，s)

表1 各組創面膿腐脫落時間比較(d，s)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01;與九一丹組比較，*P＞0.05。

*姜露散 16 6.67±0.651 16 9.67±0.888九一丹 16 7.08±0.900＊＊模型

表2 第3 d、7 d、14 d、各組創面分泌物量計分比較(s)

表2 第3 d、7 d、14 d、各組創面分泌物量計分比較(s)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01;與九一丹組比較，*P＞0.05。

7 d組別 3 d 14 d只數 計分姜露散 24 2.39±0.502＊＊ 16 1.67±0.651* 8 0.67±0.516只數 計分 只數 計分*九一丹 24 2.33±0.485＊＊ 16 1.33±0.492* 8 0.50±0.548*模型 24 1.78±0.428 16 1.25±0.452* 8 0.33±0.516*

表3 各組創面肉芽組織中溶菌酶含量比較(μm2，s)

表3 各組創面肉芽組織中溶菌酶含量比較(μm2，s)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01。

姜露散 8 1283.3550±66.39142＊＊1266.5400±70.97180＊＊597.9617±71.72339九一丹 8 1276.5467±73.77489＊＊1258.2908±75.02942＊＊ 559.6925±55.83410模型 8 691.9958±206.29910 749.2492±65.48238 602.9333±78.02048

表4 各組創面肉芽組織中IL－1β含量比較(pg/mL，s)

表4 各組創面肉芽組織中IL－1β含量比較(pg/mL，s)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01。

3 d 7 d 14 d姜露散 8 51.6633±9.44752＊＊ 27.9583±7.54641＊＊組別 只數13.6467±2.93296九一丹 8 50.6633±8.64725＊＊ 27.0633±7.56325＊＊ 12.4250±2.38189模型 8 14.1333±3.7858 11.6967±2.25507 11.2200±2.28874

2.2 各組創面膿腐脫落時間比較 見表1。

2.3 各組創面分泌物量比較 見表2。

2.4 各組創面肉芽組織中溶菌酶含量比較 見表3。

2.5 各組創面肉芽組織中IL－1β含量比較 見表4。

2.6 各組血清BUN、CREA、ALT含量比較 見表5。

表5 各組血清BUN、CREA、ALT含量比較(s)

表5 各組血清BUN、CREA、ALT含量比較(s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與九一丹組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

CREA(mmo1/L)組別 只數 BUN(mmo1/L)ALT(U/L)7 d 14 d姜露散 8 7.2283±0.24302△ 8.0167±0.76995△ 35.1033±3.13722△ 33.8683±3.79128△ 38.7000±4.93994△ 38.6400±4.36148 7 d 14 d 7 d 14 d△△九一丹 8 9.1700±1.14745* 10.5850±1.80280*47.2250±2.43482*49.4300±2.27716*43.6317±2.48398*52.9633±9.04799＊＊模型 8 6.6583±0.29546 7.0533±0.33285 32.8667±2.40935 32.6983±2.32029 37.3183±2.90987 39.7467±2.32760

3 討論

3.1 中醫對“提膿祛腐法”的認識 “提膿祛腐法”是中醫外科治療急慢性感染性創面的治療大法之一，其包含“提膿”和“祛腐”兩個方面的內容。“提膿”為化腐成膿，只有將腐肉轉化成膿汁，才能利于創面的引流;同時，“膿”本身又能促進創面的愈合及加強創面的炎性反應。“祛腐”即通過藥物或手術的作用，將創面上的壞死組織、過度增生的病理性肉芽組織以及其他影響創口順利愈合的各種病理組織(如囊壁、瘺管壁等)逐漸清除，形成相對新鮮的、引流通暢的創面，為新生肉芽組織的生長創造有利條件。“祛腐”是“提膿”的目的;“提膿”是“祛腐”的方式和手段。提膿祛腐藥物療法是中醫的特色和優勢。肛腸科常見的感染性疾病(肛周膿腫和肛瘺)的術后創面都是經過一定的手術清創過程，但是對于深部肛周膿腫及復雜性肛瘺，前者術中無法做到徹底清創，后者臨床為了保護肛門括約肌正常形態及功能，不可能將瘺管全部切除，如果能夠使用提膿祛腐藥物配合術后換藥，便能加快創面壞死及病理組織的脫落，縮短創面愈合的時間。再者，某些肛腸手術切口較小，導致術后創面引流不暢，局部出現感染或慢性炎性反應至胬肉增生時，如果能夠使用提膿祛腐藥物進行換藥，便能避免部分術后并發癥的發生。此外，肛腸疾病中藏毛竇、骶前囊腫等疾病，其手術成功的關鍵是徹底清除病理組織，但有時由于結構的復雜性和種種限制，無法全面徹底地清除這些病理組織，此時如果能夠使用提膿祛腐藥配合術后換藥，便能夠大大提高治療的成功率［24］。因此，提膿祛腐藥物療法在肛腸科乃至整個中醫外科學領域承擔著非常重要的任務。

3.2 西醫對“提膿祛腐法”的認識 “提膿祛腐法”是一種濕潤的藥物清創法，與西醫學近年發展起來的“酶學清創”在方法與效果上相似。兩者雖源于不同醫學，但卻殊途同歸［24－28］。

3.3 升丹制劑不良反應 升丹制劑在臨床上療效顯著，已沿用千余年，但升丹制劑具有一定的不良反應，過量可導致肝腎損害。其主要化學成份是粗制的HgO及Hg(NO3)2等，屬中等毒性藥物。臨床和實驗表明通過皮膚創面外用升丹制劑都有不同程度的汞吸收，其毒性有蓄積性，造成內臟的損害，甚至導致中毒死亡［29－32］。其主要的靶器官是腎臟。

3.4 姜露散全方由姜黃、露蜂房、皂角刺等組成，具有清熱解毒，提膿袪腐之功效 本研究結果顯示，姜露散組和九一丹組創面膿腐脫落時間均明顯短于模型組(P＜0.01);姜露散組和九一丹組第3 d創面分泌物量計分均明顯高于模型組(P＜0.01)。提示姜露散和九一丹能夠迅速“化腐提膿”，促進創面腐肉脫落，將其轉化成膿汁，使得創面引流通暢，從而促進新生肉芽組織的生長。第3、7 d姜露散組和九一丹組創面肉芽組織中溶菌酶含量均明顯高于模型組(P＜0.01)。溶菌酶含量分布基本表現為先升高后逐漸下降的趨勢，與創面炎性反應的時間和程度變化基本一致，而姜露散組與九一丹組第3 d溶菌酶含量就達到峰值，至第7 d時仍然保持高水平，第14 d顯著下降，且姜露散組溶菌酶含量相對較高，提示姜露散能有效地趨化和活化吞噬細胞，使得吞噬細胞能夠迅速聚集在感染創面處，來清除細菌、中和異物及細菌所產生的毒素，溶解及清除壞死組織;滲出的蛋白凝固后成為創面的保護屏障，起到為炎性反應細胞移動提供網架結構等作用。這些作用為下一步的創面修復打下了良好的基礎。因此，提高創面肉芽組織中溶菌酶的含量以調節機體局部免疫功能可能是姜露散提膿祛腐作用的機制之一［24，33］。第3、7 d姜露散組、九一丹組創面肉芽組織中IL－1β含量均明顯高于模型組(P＜0.01)。各組創面肉芽組織中IL－1β含量基本在第3 d時達到峰值，此后逐漸下降，可能與第3 d時炎性性反應程度最高有關。創面肉芽組織中的IL－1β為血管促進因子和炎性反應因子，能夠刺激創傷修復早期炎性反應，從而促進創面的修復。這可能也是解釋姜露散提膿祛腐的作用機制之一［24，33］。第7、14 d 血清 BUN、CREA、ALT 含量，九一丹組明顯高于姜露散組和模型組(P＜0.05)。提示姜露散對肝腎功能影響小，用藥安全性優于九一丹。

綜上，姜露散可能通過提高創面肉芽組織中溶菌酶含量及創面肉芽組織中IL－1β含量來起到對感染性創面提膿祛腐的作用，其用藥安全性優于升丹制劑(九一丹)，為尋找升丹制劑替代品提供更多選擇空間。本次實驗僅從創面肉芽組織中溶菌酶、IL－1β等方面探討姜露散提膿祛腐的作用機制，如需進一步明確其機制，還有待大樣本的多靶點的研究。

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