低聲壓級水平次聲在大鼠心肌纖維化中作用及機制研究

宋國良 邵尤北 裴兆輝

南昌市第三醫院心血管內科，江西南昌 330009

次聲是頻率低于可聽聲頻率的聲波（10-4～20 Hz）[1]。有研究發現，低聲壓級水平次聲能夠明顯改善心肌梗死大鼠心臟功能，增加心肌局部一氧化氮含量，降低內皮素-1及血管緊張素Ⅱ的含量[2-5]。臨床上缺血性心臟病治療藥物中，因血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）良好的治療效果而備受矚目。ACEI能夠減輕心肌纖維化，防止左室擴張，降低死亡率。本實驗擬觀察低聲壓級水平次聲對大鼠心肌纖維化的作用及機制，判斷次聲對心肌纖維化和心室重構的治療效果，可為臨床應用低聲壓級水平次聲防治心血管疾病奠定基礎，為臨床提供新的心血管疾病康復治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（中山大學動物實驗中心提供），體重150～170 g，適應性喂養1周后開始實驗。將SD按0.5%異丙腎上腺素（ISO，大連輝瑞制藥有限公司）5 mg/（kg·d）皮下注射，連續10 d建立大鼠心肌纖維化（MF）模型。選擇Infratoni-c8000TM次聲治療儀，為美國加州醫師協會研制。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將40只SD大鼠隨機分4組，每組10只。①對照組:大鼠心肌纖維化模型建立后給予雙蒸水（15mL/kg）灌胃。②藥物治療組:大鼠心肌纖維化模型建立后將卡托普利100 mg/kg，每天1次，用雙蒸水（15 mL/kg）稀釋后灌胃，連續4周。③次聲治療組:大鼠置于特制的鼠籠中，分別于 9∶00 及 15∶00，給予低頻次聲治療 4 周，2 次/d，0.5 h/次。④藥物和次聲治療組:大鼠心肌纖維化模型建立后卡托普利溶液灌胃，同時施加次聲作用。

1.2.2 血流動力學指標的測定 治療結束后，分離右頸總動脈和左股動脈，經右頸總動脈插入聚苯乙烯PE-20導管至心室，導管另一端經能量轉換器連接MP A-2000多導生理記錄儀，測定心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張壓（LVEDP）、左室壓力變化最大上升和下降速率（±LVdp/dtmax）。同時經股動脈插管記錄動脈收縮壓 （SBP）和動脈舒張壓（DBP）。

1.2.3 大鼠心肌膠原測定 治療結束后，動物采用29 g/L苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸經左心室至主動脈插管，剪破右心耳。先用200 mL的生理鹽水沖洗，再灌注含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）500 mL持續1 h。取出左心室，在解剖顯微鏡下小心切取左心室浸入40 g/L多聚甲醛溶液中作為心肌膠原測定的標本。

1.2.4 心肌Ⅰ及Ⅲ型膠原檢測 將心肌制作成石蠟切片，片厚5 μm；二甲苯脫蠟，經各級乙醇脫水，0.2%胃蛋白酶溶液37℃1 h，雙蒸水洗滌5 min×3次，0.6%過氧化氫-甲醇溶液37℃ 30 min，雙蒸水洗滌5 min×3次，磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3次，加正常血清室溫下20 min；加第一抗體（1∶100 Ⅰ型膠原抗體）37℃ 1 h，4℃過夜；PBS 洗滌 5 min×3次，滴加即用型envision置37℃烘箱40 min，PBS洗滌5 min×3次，加DAB溶液光鏡觀察下顯色，水洗，0.5%甲基綠染色，用蒸餾水洗3次，37℃烘干，二甲苯透明，封片用同濟醫科大學清平影像公司MPIAS 500型彩色病理分析系統進行分析。Ⅲ型膠原:除第一抗體為1∶100Ⅲ型膠原抗體外，余同Ⅰ型膠原。

1.2.5 血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）測定 治療結束后動物同上麻醉，體外心臟取血2 mL，用肝素抗凝，4000 r/min離心10 min，將血清放入-20℃冰箱保存待測。AngⅡ的含量采用高效液相色譜法測定[8]，試劑盒由中國原子能研究所提供。

1.2.6 血漿醛固酮放射免疫測定 腹主動脈取血2 mL，10 μL肝素抗凝，加樣操作后，4℃保溫15min，3500r/min離心15min，棄上清，測定各管沉淀的放射 Bi（cpm）。Bi/Bo（%）=[Bi（cpm）-NSB（cpm）]/[A1Bo（cpm）-NSB（cpm）]× 100%。以 Bi/Bo值為縱坐標，標準管濃度為橫坐標，在半對數坐標紙上作圖，畫出標準曲線。未知標本管的醛固酮濃度，可根據其Bi/Bo值從曲線上查得。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，組內比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組左心室Ⅰ、Ⅲ型心肌膠原蛋白表達比較

與對照組比較，藥物治療組，次聲治療組、藥物和次聲治療組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達明顯減少；次聲藥物治療組較藥物治療組及次聲治療組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達明顯減少（P<0.01）。藥物治療組及次聲治療組心肌膠原蛋白差異無統計學意義 （P>0.05），見表 1。

表1 卡托普利和次聲對大鼠左室心肌膠原積分光度的影響（μg/L，±s,n=10）

表1 卡托普利和次聲對大鼠左室心肌膠原積分光度的影響（μg/L，±s,n=10）

注:與對照組比較，aP<0.05；與藥物治療組比較，bP<0.01；與次聲治療組比較，cP<0.01

組別 Ⅰ型膠原 Ⅲ型膠原對照組藥物治療組次聲治療組藥物和次聲治療組2.78±1.001.26±0.35a 0.12±0.35a 0.78±0.25abc 1.09±0.260.72±0.19a 0.76±0.32a 0.52±0.29abc

2.2 大鼠血漿醛固酮及AngⅡ含量的變化

與對照組比較，藥物治療組、次聲治療組、次聲藥物治療組大鼠心肌醛固酮及AngⅡ含量明顯減少；次聲藥物治療組較藥物治療組及次聲治療組大鼠心肌醛固酮及AngⅡ含量減少（P<0.01）。藥物治療組及次聲治療組心肌膠原蛋白差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 大鼠血漿醛固酮及AngⅡ含量的變化（±s，n=10）

表2 大鼠血漿醛固酮及AngⅡ含量的變化（±s，n=10）

注:與對照組比較，aP<0.05；與藥物治療組比較，bP<0.01；與次聲治療組比較，cP<0.01

組別 醛固酮（μg/L） AngⅡ（ng/L）對照組藥物治療組次聲治療組藥物和次聲治療組647.8±72.0506.0±78.0a 494.0±80.0a 478.0±82.0abc 18.3±3.214.1±1.8a 14.5±2.1a 12.5±2.4abc

2.3 大鼠血流動力學變化

2.3.1 大鼠SBP、DBP、HR、LVSP變化 與對照組比較，藥物治療組、次聲治療組、次聲和藥物治療組SBP、DBP和LVSP差異有統計學意義（均P<0.05）；與藥物治療組及次聲治療組大鼠比較，藥物和次聲治療組SBP顯著降低，DBP和LVSP顯著升高（P<0.01）。HR比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。

表3 大鼠 SBP、DBP、HR、LVSP 指標觀察（±s，n=10）

表3 大鼠 SBP、DBP、HR、LVSP 指標觀察（±s，n=10）

注:與對照組比較，aP<0.05；與藥物治療組比較，bP<0.01；與次聲治療組比較，cP<0.01；SBP:動脈收縮壓；DBP:動脈舒張壓；HR:心率；LVSP:左室收縮壓

組別 SBP（kPa） DBP（kPa） HR（次/min） LVSP（kPa）對照組藥物治療組次聲治療組藥物和次聲治療組18.2±2.916.6±2.1a 17.3±2.4a 15.5±2.6abc 5.9±1.38.1±1.9a 8.7±2.1a 9.6±1.8abc 453±48432±48428±51426±5014.5±2.619.1±3.6a 18.3±2.9a 19.4±3.2abc

2.3.2 大鼠 LVEDP、LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax變化 與對照組比較，藥物治療組、次聲治療組，次聲和藥物治療組±LVdp/dtmax均顯著升高 （P<0.05），LVEDP 顯著降低 （P<0.05）；與藥物治療組及次聲治療組大鼠比較，藥物和次聲治療組±LVdp/dtmax顯著升高（P<0.01）。HR差異無統計學意義（P>0.05），見表 4。

3 討論

心肌纖維化是一個復雜的病理過程，在心肌組織結構中膠原纖維過量積聚、其膠原濃度顯著升高或膠原容積分數顯著增加[6]，涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）系統、免疫系統和多種細胞因子參與，在不同心臟疾病甚至同種疾病的不同類型心肌纖維化的形成機制有所不同。醛固酮促進心臟細胞的Ⅰ型和Ⅲ型膠原基因表達，使膠原合成增多[7-9]。

表4 大鼠 LVEDP、LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax指標觀察（±s，n=10）

表4 大鼠 LVEDP、LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax指標觀察（±s，n=10）

注:與對照組比較，aP<0.05；與藥物治療組比較，bP<0.01；與次聲治療組比較，cP<0.01；LVEDP:左室舒張壓；LVdp/dtmax:左室壓力變化最大上升速率；-LVdp/dtmax:左室壓力變化最大下降速率

組別 LVEDP（kPa）LVdp/dtmax（kPa/s）-LVdp/dtmax（kPa/s）對照組藥物治療組次聲治療組藥物和次聲治療組2.8±0.51.8±0.4a 1.9±0.5a 1.4±0.3abc 746±66926±70a 935±68a 955±72abc 622±72748±66a 752±60a 770±64abc

本實驗結果顯示，卡托普利及次聲治療4周后，藥物或次聲治療組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型行膠原蛋白表達明顯減少，AngⅡ及醛固酮明顯減少，心肌纖維化明顯減輕。藥物和次聲合用治療，大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ行膠原蛋白表達明顯進一步減少，AngⅡ及醛固酮明顯進一步減少，心肌纖維化進一步減輕。血流動力學結果表明，藥物或次聲治療均能改善大鼠血流動力學，發現藥物組及次聲組大鼠心肌纖維改善程度無明顯差異，提示低聲壓級水平次聲治療大鼠心肌纖維化有效，改善心室重構。美國許多醫師使用次聲治療儀輔助治療創傷、瘢痕、炎癥等疾病時，發現低聲壓級水平的次聲可以促進血液循環、擴張血管、減少纖維性瘢痕增生、消退炎癥及加速傷口的愈合[9-12]。本實驗結果可能與低聲壓級水平次聲上述作用有關。

心肌纖維化涉及RAAS系統及多種細胞因子參與，在不同心臟疾病甚至同種疾病的不同類型心肌纖維化的形成機制有所不同。心肌纖維化導致心室重構，常伴隨發生高血壓、心肌梗死及心力衰竭等疾病。心肌出現纖維化時AngⅡ的含量明顯增加，使心肌纖維化加重；醛固酮分泌增加，促進心臟細胞的Ⅰ型和Ⅲ膠原基因表達，使膠原合成增多[5]，降低心肌間質膠原分泌，減緩細胞間質膠原堆積和纖維化進程。低聲壓級水平次聲減輕心肌纖維化可能在于:①本實驗結果表明低聲壓級水平次聲可使血漿AngⅡ分泌降低，醛固酮分泌減少，使心肌Ⅰ、Ⅲ行膠原蛋白表達明顯降低，減輕心肌纖維化。②本實驗結果表明低聲壓級水平次聲改善心臟血液動力學參數，增強心肌收縮力，改善心功能。

綜上所述，通過對低聲壓級水平次聲在大鼠心肌纖維化中作用研究，發現低聲壓級水平次聲可改善大鼠心肌纖維化及心室重構，聯合應用ACEI治療，其效果進一步得到鞏固，可能與膠原蛋白表達，血漿醛固酮及AngⅡ有關，研究結果可為低聲壓級水平次聲康復治療心血管疾病提供實驗依據，為心血管康復治療提供新途徑。且低聲壓級水平次聲治療價格低廉，對我國廣大城鄉患者而言，經濟且易于普及，具有重要現實和社會意義。

[1]Zhuang Z，Pei Z， Chen J.Infrasound-induced changesons exual behavior in male rats and some underlying mechanism[J].Env Tox-icol Pharmacol，2007，23（121）:111-114.

[2]吳敬國，梁艷冰，唐皓，等.低聲壓級水平次聲對心肌梗死大鼠心肌纖維化的影響及機制研究[J].心臟雜志，2010，22（6）:852-854.

[3]劉召紅，初國良，朱妙章，等.低聲壓級水平次聲對心肌梗死大鼠心功能的影響及機制[J].心臟雜志，2009，21（5）:665-668.

[4]Voloshenyuk TG，Hart AD，Khoutorova E，et al.TNF-α increases cardiac fibroblast lysyl oxidase expression through TGF-β and PI3Kinase signaling pathways [J].Biochem Biophys Res Commun，2011，413（2）:370-375.

[5]Pan Z，Sun X，Shan H，et al.MicroRNA-101 inhibited postinfarct cardiac fibrosis and improved left ventricular compliance via the FBJ osteosarcoma oncogene/transforming growth factor-β1 pathway[J].Circulation，2012，126（7）:840-850.

[6]高淑卿，朱鵬立.心肌纖維化的研究進展[J].醫學綜述，2009，15（2）:1627-1629.

[7]Yu J， Fei J， Azad J， et al.Myocardial protection by Salvia miltiorrhiza Injection in streptozotocin-induced diabetic rats through attenuation of expression of thrombospondin-1 and transforming growth factor-β1[J].J Int Med Res，2012，40（3）:1016-1024.

[8]Lei B，Hitomi H，Mori T，et al.Effect of efonidipine on TGF-β1-induced cardiac fibrosis through Smad2-dependent pathway in rat cardiac fibroblasts[J].J Pharmacol Sci，2011，117（2）:98-105.

[9]Nadal JA，Scicli GM，Carbini LA，et al.AngiotensinⅡ stimulates migration of retinal microvascular pericytes:invo-lvement of TGF-beta and PDGF-B B[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，282（2）:739-748.

[10]陳景藻.次聲的產生及生物學效應[J].國外醫學:物理醫學與康復分冊，1999，19（1）:15-17.

[11]Pei ZH，Sang H，Li R ，et al.Infrasound-i nduced hemodynamics，ultrastructure and molecu lar changes in the rat myocardium[J].Environ Tox icol，2007，22（2）:169-175.

[12]裴兆輝，丁紅新，陳景藻，等.次聲對大鼠心率與血壓影響實驗觀察[J].軍事醫學科學院院刊，2005，29（3）:208-210.