經皮自體移植濃縮骨髓干細胞治療骨不連的動物實驗研究

劉亞云 楊保華 陳光連

骨不連是骨科治療中較常見并發(fā)癥，發(fā)生率大約為5%～10%［1］。重新內固定術和各種植骨術等傳統(tǒng)治療方法，雖可使多數(shù)骨不連獲得連接。但因后期手術創(chuàng)傷及可能出現(xiàn)的并發(fā)癥使之成為骨科難癥。近年來，隨著干細胞技術的發(fā)展，利用骨髓干細胞的分化成骨潛能，為微創(chuàng)治療骨不連提供了條件［2］。通過直接在骨不連部位移植成骨母細胞，提高細胞募集階段的質與量，加速骨折的愈合過程的實驗研究，為臨床治療骨不連提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物骨不連模型的制作 選用兔齡5～6個月清潔級(二級)雌性南昌大白兔32只，體重2.5～3.2 kg，隨機分為A、B兩組分別為實驗組(干細胞組)及對照組(內固定植骨術)。全麻后，無菌操作下在“切除截骨骨不連模型”的基礎上改進，制作一側橈骨骨損1.0 cm(包骨膜)骨不連模型。

1.2 兔橈骨骨不連治療實驗

1.2.1 干細胞組 經X線檢查確定骨缺損模型成功。兔子無菌麻醉下，用含抗凝劑(肝素)無菌注射器，于髂后嵴隆起處刺入髂骨達骨松質，抽吸骨髓，在同一深度抽取最大量骨髓(l ml)后。更換穿刺點繼續(xù)抽吸，但兩個穿刺點必須有1 cm左右的間隔，共抽吸約6 ml骨髓液。這些骨髓抽吸液在細胞分離器下離心5 min獲取一濃縮的淡黃層約1 ml(即1000 /cm3以上母細胞外和一些單核細胞等)。將制作好的自體濃縮骨髓母細胞，用5 ml注射器在透視下注射到骨不連斷端處約4 mm深，針尖輕輕剝離，創(chuàng)造容納空間，將骨髓緩慢注入。取出時邊退邊做輕度的前后抽動，使穿刺通道被周圍組織充填，同時以棉簽壓迫進針處10 min，未見明顯液體流出。

1.2.2 內固定植骨術組 兔子無菌麻醉下，經手術切開暴露骨折端，咬除局部骨痂及兩端的硬化骨，打通髓腔，應用鋼板固定，從自身髂骨取松質骨適量，制成顆粒骨植于骨折端周圍。

1.3 觀察指標 ①觀察術后兔的活動及傷口愈合情況;②分別于術后8、12周，每組每次隨機選取8只兔麻醉后拍攝前后位及側位X線片(投照統(tǒng)一條件為電壓40kV、電流50 mA、曝光時間0．2s、距離為60 cm)。然后耳緣靜脈注入空氣處死，先肉眼觀察骨痂生長情況，再行HE染色組織學觀察，參照Lane-Sandhu X線評分標準及組織學評分標準，對各組骨不連愈合情況進行評分。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，兩組間計量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗。設定P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般觀察結果 大體觀察所有動物都能耐受麻醉和手術，術后動物無1例死亡。術后第l天進食較少，活動也少。第2天開始基本恢復正常，手術切口無紅腫及滲液等，一期愈合，皮膚縫線自行脫落。

2.2 放射學檢查 A組術后8周骨不連間隙基本消失，連續(xù)骨小梁存在并已通過骨不連間隙;術后12周骨痂已基本完成骨化，骨外形接近正常骨形態(tài)，部分髓腔再通，靠近尺骨部分密度尤其高。B組術后8周骨痂多且呈梭型包繞骨不連間隙，貼近鋼板側的骨不連先愈合，骨髓腔基本通暢，但骨紋理較亂;術后12周骨不連間隙骨性連接，骨紋理出現(xiàn)較規(guī)律的縱向排列，髓腔再通。12周A、B組骨不連愈合的Lane-Sandhu放射學評分分別為(10.27±1.10)、(9.96±0.83)分，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 組織學切片觀察結果 第8周A組可見大量編織骨樣組織，可見軟骨及骨演化交接區(qū)，可見較多成骨細胞，排列較整齊，部分哈弗氏管重建，骨結構接近正常形態(tài)，局部仍可見軟骨細胞集落樣增生，仍可見骨質未全部連接，局部有纖維組織;B組成熟骨組織較多，有少許軟骨基質填充。第12周A組骨缺損完全修復，成熟骨小梁形成，骨髓腔已貫通，哈佛氏系統(tǒng)形成，骨小梁排列正常，結構完全恢復;B組可見大量編織骨樣組織，骨形態(tài)有序，可見大量成骨細胞，肉芽組織較少。兩組Lane-Sandhu組織學標準評分比較見表1。

表1 兩組Lane-Sandhu組織學標準評分比較(分，±s)

表1 兩組Lane-Sandhu組織學標準評分比較(分，±s)

注:各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)

組別 第8周 第12周A組16 14.20±0.63 16.35±1.21 B組16 14.35±1.20 18.20±1.20 n

3 討論

3.1 骨不連的傳統(tǒng)治療方法 骨折的正常愈合過程終止被稱為骨不連，美國食品與藥品管理(FDA)將“損傷和骨折后至少9個月，并且沒有進一步愈合傾向已有3個月，稱為骨不連”［3］。目前，骨不連的治療可分為開放與閉合治療。開放手術治愈率達90%，療效確切，并且可以盡早恢復肢體功能，提高生活質量，因此是治療的金標準［4］。其治療方法包括切開植骨加內固定等，自體骨因兼有骨誘導活性和骨傳導作用且攜有成骨作用的骨髓細胞，因而成骨效果好。但自體骨來源有限，不能滿足臨床需要，特別是供骨區(qū)的疼痛、畸形無法完全避免，尤其不適用于兒童及年老體弱者。而且需切開供、受骨區(qū)的軟組織，創(chuàng)傷大，存在取材區(qū)域受限、供區(qū)并發(fā)癥多、開放植入導致組織創(chuàng)傷使骨折端的血運進一步破壞及需要二次取出內固定物等缺點。尤其是當骨不連部位組織條件差，不具備切開植骨條件時，治療將更加困難。

3.2 經皮自體移植濃縮骨髓干細胞 骨不連時患者骨折斷端成骨細胞數(shù)量較少且活性較低，因此有必要局部補充具有成骨能力的種子細胞［5］。移植自體骨髓干細胞能夠利用其向成骨細胞分化促進骨不連的愈合。問題主要是骨髓干細胞含量過低，骨髓中間充質干細胞的數(shù)量很少。Hernigou在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)移植的骨髓干細胞治療骨不連的有效性與移植骨髓中母細胞的濃度、數(shù)量有關，而且提示在進行骨髓注射治療時將母細胞濃度控制在1000/cm3以上是很有必要的。本實驗通過移植濃度相對較高的骨髓干細胞治療的16例骨不連動物均達到影像學及組織學骨折愈合標準。

本研究的結果提示兩組術后8周、12周X線測定、組織病理切片均形成骨性連接，新骨形成、骨改建及骨髓成熟度指標相當，即兩組效果相當。而自體骨髓移植具有以下特點:①來源豐富，無排斥反應;②操作簡單、安全，大多數(shù)患者不需住院，減輕患者經濟負擔及心理負擔;③創(chuàng)傷小，痛苦少，可以反復治療;④尤其對于局部軟組織條件差，不宜再次手術患者。從某種意義上講，經皮自體移植濃縮CFU-F治療骨不連可以替代開放的植骨術，或者是開放植骨術后出現(xiàn)骨折延遲愈合及不愈合時的補充治療措施。

［1］ 常玉立，孫天勝．骨不連的研究現(xiàn)狀及展望．中國康復理論與實踐，2007(13):450-453.

［2］ 王廷華，李力燕，Mcdonald JM．干細胞理論與技術．第2版．北京:科學出版社，2009:56-61.

［3］ T Can ale．坎貝爾骨科手術學．王巖，主譯．第11版．北京:人民軍醫(yī)出版社，2009:2768-2783.

［4］ 常玉立，劉智，孫天勝．骨不連及其干細胞移植療法的研究進展．感染、炎癥、修復，2007，8(3):182-185.

［5］ 孫志波，楊述華，禹志宏，等．腺病毒介導的骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因轉移促進人間充質干細胞成骨化．鄖陽醫(yī)學院學報，2008，27(3):199-201.