遠隔缺血后處理對腦缺血再灌注損傷后自噬的影響

蘇靜緣， 李曉明， 齊廣偉， 梁國標

近幾年，科學研究人員先后提出缺血預處理(Ischemic Preconditioning，IP)，缺血后處理(Ischemic Postconditioning，IPC)，遠隔缺血預處理(Remote Ischemic Preconditioning，RIP)和 RIPC 的概念，并證明了這些處理方法能發揮內源性機制對CIR損傷具有保護作用［1～4］。

微管相關蛋白質1輕鏈(MAP1-LC3)是哺乳動物自噬體形成相關蛋白，當哺乳動物細胞發生自噬時，細胞內LC3的含量及LC3-I向LC3-II的轉化均明顯增加。通過檢測細胞內LC3表達變化，可以方便地判斷細胞狀態，判斷其自噬是被誘導還是被抑制［5］。自噬體形成后，溶酶體與之融合，釋放溶酶體酶，將自噬泡中的蛋白質和細胞器消化溶解;Ellis等人報道，缺血Cathepsin B的小鼠有神經元丟失，腦萎縮等現象的出現，說明Cathepsin B能維持中樞神經系統的正常功能［6］。

本文采用了大鼠腦缺血再灌注(CIR)模型，檢驗RIPC對CIR的保護作用，比較后處理和模型組LC3和Cathepsin B表達的差異性，旨在闡述自噬-溶酶體在RIPC對CIR的影響中的作用，為RIPC對CIR的保護機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔健康雄性SD大鼠42只，體重210～260g，由哈爾濱醫科大學第二臨床醫學院實驗動物中心提供。術前12h禁食，自由飲水。將 SD大鼠隨機分為5組:假手術組(Sham，n=10)，缺血再灌注 3h 組(I/R3h，n=6)，缺血再灌注24h組(I/R24h，n=10)，缺血再灌注3h+下肢缺血后處理組(RIPC3h，n=6)，缺血再灌注24h+下肢缺血后處理組(RIPC 24h，n=10)。

1.2 主要試劑和儀器 一抗LC3購自sigma公司;Cathepsin B購自武漢博士德試劑公司;二抗試劑購自北京中杉金橋公司PV6001;DAB試劑盒購自北京中杉金橋公司ZLI9031;2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)購自sigma公司。

1.3 制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型模型組和處理組缺血再灌注均采用Longa法［7］制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型，用10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術臺上，頸部正中縱向切口，暴露右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，分離右側頸總動脈，在靠近頸外動脈根部結扎頸外動脈，近心端結扎頸總動脈，血管夾夾閉其遠端，并在結扎線和血管夾之間的頸總動脈上剪一小口，切口遠心端打一松口，將尼龍線自剪口處插入，縛緊缺血遠端的絲線，松開血管夾，經頸總動脈分叉處通過頸內動脈到大腦中動脈開口處，至有阻力不能再進為止，插線長度約18～20cm(從分叉處算)。剪斷線頭、縫皮。假手術組不進線外，其余過程同缺血組。正常組不干預。在灌注組在缺血90min后輕輕抽出魚線至有阻力感，表明線頭已退出至頸總動脈剪口處。術中保持動物肛溫37℃左右。

1.4 下肢缺血后處理的介入 分離大鼠雙側股動脈主干，在缺血即刻使用動脈夾夾閉股動脈15min，再放開15min，重復3次。假手術組和對照組僅分離股動脈，不做任何處理。

1.5 神經功能評分 麻醉蘇醒后，將動物放回鼠籠，自由飲食。參照 Garcia評分法［8］，各組 CIR后24h采用雙盲法進行神經功能評分。Garcia評分從大鼠自主運動、體態對稱性、前肢伸展功能、網屏實驗、身體雙側觸覺、雙側胡須反射等6方面評定大鼠神經功能損傷程度;功能正常時得分最高，18分;功能損傷最嚴重者得分最低，3分(見表1)［9］。

表1 Garcia大鼠神經功能評分標準

1.6 腦梗死體積的檢測 假手術組，缺血再灌注24h組，缺血再灌注24h+下肢缺血后處理組隨機取4只鼠進行TTC染色。鼠再灌注24h后，過量麻醉致死，斷頭取腦，用生理鹽水沖洗后放于-20℃冰箱冷凍20min;將腦沿冠狀面切4刀，切成5片，迅速將腦片置10ml的1%的TTC溶液中，放入37℃溫箱15～30mim，其間每10min翻動一次，經染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而腦梗死區呈白色。將染后的腦組織置10%的福爾馬林溶液中固定24h。固定后拍照，用電腦圖像分析系統(Image Pro plus 6.0)測定腦梗死體積。

1.7 取材及切片 各組鼠被過量麻醉致死后，斷頭取腦進行24h、4%多聚甲醛固定，自視交叉向前后2mm切取冠狀腦片，取腦片，常規脫水、透明、石蠟包埋和切片，作HE染色和免疫組化染色。

1.8 LC3和Cathepsin B免疫組織化學染色切片常規脫蠟至水;蒸餾水洗凈后檸檬酸微波修復15min，自然冷卻至室溫，PBS洗;3%過氧化氫孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS洗;10%BSA封閉10min;滴加一抗(LC3 1∶400，Cathepsin B 1∶200)，至于濕盒中，4℃孵育過夜，PBS沖洗;滴加生物素標記的二抗，37℃孵育1h，PBS沖洗;DAB顯色，充分水洗;蘇木素淺染5min，充分水洗;酒精脫水，二甲苯透明，封片。每例大鼠隨機取6張切片，在缺血再灌注側皮質半暗帯區隨機選取10個不重疊高倍鏡視野(×400)，計數陽性細胞(細胞質含棕黃色顆粒)。

1.9 統計學分析 統計分析應用 SAS 9.1.3統計軟件數據以±s表示，差異顯著性檢測采用方差分析檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評分 鼠右側大腦中動脈缺血閉塞90min再灌注24h后，除假手術組外，各組動物出現明顯神經缺損癥狀，大多表現為不同程度的左側前肢屈曲、向左側旋轉，行走時向左側傾倒;RIPC組大鼠神經功能缺陷癥狀比I/R組明顯減輕。各組評分相比較，差異有顯著性(P＜0.01，見表2)。

表2 RIPC對大鼠神經功能的影響(χ ± s，n=10)

2.2 大鼠腦梗死體積 RIPC能減少CIR后腦梗死體積。圖1為再灌注24h后，TTC染大腦梗死體積結果，可見正常腦組織呈玫瑰紅色，而腦梗死區呈白色，可見缺血組白色區域大于后處理組。經統計分析表明RIPC組大鼠腦梗死體積明顯低于缺血模型組(P ＜0.01)。

圖1 TTC檢測RIPC對大鼠腦梗死體積的影響

2.3 病理形態學觀察 HE染色后光鏡下組織學所見，CIR后可見梗死灶和缺血半暗帯，梗死灶中心腦組織發生液化性壞死，神經氈溶解，出現明顯的神經元的核固縮，胞體縮小變形，胞質尼氏小體消失，HE染色胞質呈深伊紅色的紅色神經元。RIPC組腦組織損傷程度明顯低于單純缺血組，假手術組基本正常(見圖2)。

圖2 RIPC影響CIR的HE結果(×400;A:Sham組;B:I/R24h組;C:RIPC24h組)

2.4 RIPC對 CIR損傷后LC3和Cathepsin B表達的影響 免疫組織化學結果顯示:LC3和Cathepsin B陽性細胞主要位于缺血側梗死灶周圍的半暗帶神經元的胞質內，胞質含棕黃色顆粒。假手術組LC3和Cathepsin B陽性表達水平均較低;缺血再灌3h組大鼠大腦缺血半球皮質LC3和Cathepsin B陽性表達水平較假手術組明顯增加(P＜0.05);RIPC再灌后3h組LC3和Cathepsin B陽性表達水平較假手術組有明顯增加(P＜0.05)，與缺血組無顯著差異(見表3、圖3)。

表3 再灌注3h后各組LC3，Cathepsin B表達情況(±s)

表3 再灌注3h后各組LC3，Cathepsin B表達情況(±s)

組間兩兩比較*P＜0.05vs sham組

組別LC3 Cathepsin B Sham I/R3h RIPC3h 4.85 ±0.39 21.2 ±0.66*20.93 ±0.75*5.59 ±0.25 13.93 ±0.20*13.54 ±0.25*

圖3 各組再灌注3h后LC3，Cathepsin B免疫組織化學染色(×400)

缺血再灌注24h組大鼠大腦缺血半球皮質半暗帯區LC3陽性表達水平下降至與假手術組比較無明顯差異;但RIPC再灌注24h組LC3陽性表達與缺血再灌注24h組比較存在明顯的差異(P＜0.05)。RIPC再灌注24h組大鼠大腦缺血半球皮質半暗帯區Cathepsin B陽性表達水平與假手術組比較有明顯差異，并且與缺血再灌注24h組比較也存在明顯的差異(P ＜0.05，見表4、圖4)。

表4 再灌注24h后各組LC3，Cathepsin B表達情況(±s)

表4 再灌注24h后各組LC3，Cathepsin B表達情況(±s)

組間兩兩比較*P＜0.05vs sham組;#P＜0.05vs I/R24h組

組別LC3 Cathepsin B Sham I/R24h RIPC24h 4.80 ±0.48 4.96 ±0.24 20.22 ±0.25*#5.58 ±0.24 7.88 ±0.38*14.02 ±0.35*#

圖4 各組再灌注24h后LC3，Cathepsin B免疫組織化學染色(×400)

3 討論

近年來已經有文獻報道IPC在動物CIR中具有神經保護作用。由于腦的特殊性，很難直接將IPC應用于CIR損傷的治療。RIP的實驗結果提示RIPC應用的可能性，同時，也為CIR的治療提供了可行性。本實驗應用大鼠線栓法制備了大鼠CIR模型，模擬人類CIR損傷，在腦缺血即刻給予RIPC的大鼠，經TTC染色和神經功能評分均提示RIPC能減少CIR損傷后腦梗死體積和改善大鼠的神經功能。本實驗也運用HE染色，從微觀形態方面進一步證明RIPC能明顯減輕CIR后腦的損傷，改善腦功能;RIPC能有效的抑制神經元的損傷和神經凋亡;經RIPC的腦組織，半暗帯較缺血組的小，神經氈溶解程度較缺血組的輕。這與 Ren等人［4］和 Zhou等人［10］的研究結果一致。實驗還發現越早實施RIPC，越能更好的保護CIR損傷［11］。

自噬是通過自噬溶酶體系統對自身細胞質內異物、損傷和衰老細胞器進行吞噬降解的過程，它可以使蛋白等能量物質循環再利用，對細胞生長，器官正常發育具有重要的作用。大鼠局灶性CIR損傷后能激活自噬溶酶體途徑［12］。在本研究中，我們研究RIPC對CIR的神經保護作用是否與自噬有關。

我們應用LC3免疫組化定位檢測自噬體表達情況，結果表明應用RIPC的腦組織半暗帯區自噬體增多。Sheng等人［13］在研究預處理對CIR的保護作用時發現自噬在預處理刺激后表達增加;Qi等人［14］在研究RIPC對大鼠CIR的保護作用中也發現自噬有助于RIPC對大腦的神經保護作用。以上研究均提示RIPC對CIR損傷的保護作用與自噬有關。

如前所述，AKT/GSK3β是RIPC對CIR損傷保護作用的重要信號通路［2，9］。最近也有研究提供證據，AKT/GSK3β是自噬誘導神經保護作用的關鍵分子。Qi等人研究闡述RIPC上調AKT和GSK3β磷酸化;若應用AKT通路抑制劑LY294002，通過抑制GSK3β磷酸化可阻滯RIPC誘導的自噬體的形成;提示AKT/GSK3β磷酸化在RIPC上調自噬中有重要作用［14］。

盡管自噬誘導Ⅱ型程序性死亡，但自噬的保護作用在最近缺血研究中已經被闡述［13］。本實驗闡述了自噬在RIPC保護CIR損傷中的作用，特別是半暗帯區。溶酶體是真核細胞蛋白質降解的主要場所，被稱為細胞內的消化器官。自噬活動促進了溶酶體酶的形成和活化，自噬體中被包裹的細胞器等物質最終在溶酶體中被溶酶體酶降解。溶酶體含有多種溶酶體酶，自噬活動促進了溶酶體酶的形成和活化，其中Cathepsin B是半胱氨酸蛋白酶類之一。本實驗對Cathepsin B免疫組化結果顯示，RIPC組較I/R組Cathepsin B表達增加，這可能與RIPC的腦保護作用有關。也有研究表明Cathepsin B是自噬和凋亡的分子聯系［15］。

雖然我們闡述了自噬可能與RIPC保護CIR損傷有關，但自噬減少缺血再灌注損傷的機制仍然不十分清楚。這可能是應用RIPC在早期缺血再灌注損傷時提高自噬活動，通過快速清理浪費的或者有害的信號通路和組織細胞內的毒性級聯反應以保護神經元;另外，自噬還可能有助于高分子降解以補償卒中后腦內能量的耗竭。然而，RIPC的神經保護作用中自噬溶酶體的作用機制還需要進一步的研究。

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