基于流式細胞攝像技術（FlowCAM）的赤潮藻類識別分析初探＊

余肖翰，曾松福，曹宇峰，陳 瑤，謝杰鎮，鄭少平

（1.國家海洋局 廈門海洋環境監測中心站，福建 廈門361008；2.廈門大學 信息科學與技術學院，福建 廈門361005）

赤潮是在特定的環境條件下，海水中某些浮游植物、原生動物或細菌爆發性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害生態現象。近年來，隨著經濟和社會的發展，我國沿海地區赤潮爆發的頻率和規模都在增加。赤潮已經成為制約我國沿海經濟可持續發展的一個重要因素，引起了政府和社會各界的廣泛關注［1-2］。如何準確地進行赤潮的監測，采取有效的防治措施，減少赤潮造成的危害和損失，已經成為海洋環保部門的當務之急，而這些都離不開對浮游生物的鑒定。

流式細胞攝像系統（Flow Cytometer And Microscope，Flow CAM）技術是將流式細胞分析技術與顯微成像技術相結合的新興技術，它可以在分析流體的同時高分辨率地實時顯示和存儲每個微粒的數字彩色圖像，通過專業軟件分析、篩選、分類、查看相關信息，快速分辨出水樣中藻類，直觀地看到結果。其高效率、高靈敏度、高分辨率和高精度等特點，使得試驗人員可以對赤潮生物細胞進行同步、迅速并且多參數的定量和定性分析，這對赤潮生物鑒定、浮游生物多樣性的研究有著重要意義。

本文章采用流式細胞攝像系統技術采集赤潮藻類樣本，構建福建南部海域的赤潮生物圖譜數據庫，在該圖譜數據庫的基礎上，使用VisualSpread軟件自動識別法對赤潮藻類樣品進行鑒定；此外還采用另一種分析方式即通過Matlab開發的運算描述子來對樣品進行二次分析歸類，并對兩種方法的識別精確度進行比較。

1 設備與原理

1.1 FlowCAM系統組成

Flow CAM流式細胞攝像系統是一套將流式細胞儀和顯微鏡的功能以及成像和熒光技術結合到一起的新型的數字式流式細胞分析系統，由三個子系統構成：流控系統，光學系統和電學系統（圖1）。

圖1 Flow CAM體系結構示意圖Fig.1 A sketch map of Flow CAM structure

1.2 技術路線

通過不斷摸索，實驗人員總結出一套流式細胞攝像系統與顯微鏡鑒定比對技術路線，以此建立圖譜庫并對識別率進行計算分析（圖2）。

圖2 FlowCAM技術路線圖Fig.2 Technology Scheme of the FlowCAM

2 福建南部海域赤潮生物圖譜數據庫的構建

Flow CAM配置多個放大倍數的顯微物鏡，根據分析顆粒物的大小范圍，針對性選擇安裝其中某一個，并使用與所安裝的物鏡相對應的VisualSpreadsheet采集軟件（表1）。

表1 顯微物鏡和流通池的配對Table 1 Matching between microobjective and flow cell

采集模式使用自動拍攝模式見圖3。

圖3 自動拍攝模式示意圖Fig.3 Automatically shooting mode

濃度與顆粒采集計算式為

式中，M為粒子濃度；C為顆粒數；R為圖像采集率；E為結束時間；S為開始時間；F為刻度像素；D為寬度。

實驗組采用課題研究與其它監測任務相結合的方式，采集海洋浮游植物網樣與水樣用于圖譜庫的分析和建立。未爆發赤潮時則通過分析其它監測任務所采集的樣品進行圖片收集工作；赤潮爆發時則迅速派專人到現場采集樣品進行分析；赤潮已消退較快而無法派專人現場采集的，則通過福建省其他相關海洋部門收集樣品。

以2010-06-14日深滬灣爆發的米氏凱倫藻赤潮樣品測試為例，當采用100μm孔徑的篩絹過濾樣品所獲得濾液，選擇100μm流通池和20倍顯微物鏡，打開相應倍數的軟件并設置，進行圖片采集（圖4）。具體實驗過程中針對不同水樣采用了50，100，150，200，250，300和600μm等各種孔徑的篩絹過濾后的濾液進行分批次鑒別。

圖4 TIF拼圖文件Fig.4 TIF puzzle file

使用VisualSpread將采集的藻類進行排列，并在拼圖頁內顯示，將選取圖片歸到Libraries（庫文件）中。

實驗人員選擇默認參數作為篩選變量，其中主要關注ESD、PPC、Aspect Rtio等重要參數，需進行進一步詳細設置（圖5）。

圖5 篩選參數設置Fig.5 Settings of screening parameters

根據本次發生赤潮的米氏凱倫藻進行篩選，建立米氏凱倫藻庫文件存入圖譜數據庫中（圖6）。

圖6 藻類入庫截圖Fig.6 Storing screenshots of algae

3 描述子算法樣本分析

使用Matlab2009對數據的多重處理進行進一步的深入開發，通過對藻類樣本圖像的特征提取并結合SVM算法作分類計算［3-7］。

本研究不對圖像預處理（如灰度處理、圖像去噪、平滑與銳化的濾波、膨脹與腐蝕等）進行贅述，直接采用處理后的切割圖片進行特征分析識別。

3.1 特征提取

使用不變矩特征采用Hu［8］構造7個經典的不變矩，特征的維數為7維。

使用傅里葉描述子進行輪廓特征提取，特征的維數為64。

使用形態譜算法形態譜提供了40個形態特征［9］。

7個自定義的形態特征：包括細胞圖像的長軸長度（Major AxisLength）、短軸長度（Minor Axis Length）、周長（Perimeter）、面積（Area）、伸長度（Major Axis Length／Minor Axis Length）、矩形度（Area／（Major Axis-Length×Minor AxisLength））和圓度（4×Pi×Area／Perimeter2）［10］。

3.2 藻類圖像特征降維

1）通過流式細胞攝像系統采集了各種藻類照片5 000余張。目前為止，收集到的可以建庫的福建南部典型的赤潮種類共計15種，如中肋骨條藻、夜光藻、東海原甲藻、米氏凱倫藻、血紅哈卡藻（又名血紅阿卡藻，紅色赤潮藻［11］）和多紋膝溝藻等（圖7）。

2）對這6種福建南部典型赤潮藻類的1 500個樣本進行特征提取，得到118維的組合特征向量。由于不同的特征提取算法，得到的特征向量長度差異較大，實驗組又通過歸一化多級主特征向量評估準則進行特征降維（圖8）。

圖7 6種福建南部海域典型赤潮種類Fig.7 Six typical species of red tide algae in the sea area south of Fujian

圖8 歸一化多級主特征向量評估示意圖Fig.8 A sketch map of normalized multi-level main eigenvector assess

各特征向量降維前后的長度變化情況見表2：

表2 降維處理后各特征向量維數變化表Table 2 Changes in dimensions of eigenvectors after dimensionality reduction

3.3 SVM-KNN多值分類器

支持向量機（SVM）是從線性可分情況下的最優分類發展而來，其基本原理可以用二維線性可分的分類問題進行解釋。如圖9所示，實心點和空心點代表兩類樣本，H為分類線，H1、H2分別為經過各類中離分類線最近的樣本點且平行于分類線的直線，它們之間的距離叫做分類間隔。所謂最優分類線就是要求分類線不但能將兩類正確分開，而且使分類間隔最大［12］。

圖9 二維線性可分情況下的最優分類線Fig.9 The optimal classification line under the two-dimensional linear separable case

構造方式采取一對一方式，共訓練了6個SVM二值子分類器，所取得函數都是徑向基（RBF）函數見式（2）：

KNN算法中k取值為10，ε取值為0.75，r為SVM的參數g，c為懲罰系數。

以徑向基（RBF）為核函數的支持向量機作為識別器，參數C、γ采用上面介紹的網格搜索方法確定，分別取C=0.5，γ=0.062 5對6種藻類進行分類識別實驗。

4 算法比對結果

4.1 VisualSpreadsheet自動識別結果

VisualSpreadsheet是FlowCAM配套的一套專業控制工作和分析顆粒物的軟件，從1999年問世至今不斷完善著各類自定義粒子成像。由于本課題是使用VisualSpreadsheet本身作為圖譜數據庫的采集、編輯、建庫工具，因此圖譜數據庫中已入庫的1 500個樣本不能直接作為比對標準。而在比對過程中，只能使用已有水樣并從中取1 500個清晰圖片樣本進行分析，其中不可避免因為入庫樣本與測試水樣中藻類顆粒的相似度較高，造成VisualSpreadsheet結果表現較好（表3）。

表3 VisualSpreadsheet實驗精度表Table 3 Experimental accuracy of VisualSpreadsheet

另外值得注意的是，Flow CAM系統采用的是多光學鏡頭配合相應流通池進行圖片采集，因此實驗過程中僅采取單一物鏡取得的數據進行識別分析，避免了因不同物鏡造成的同類藻形狀分辨率大小差異帶來的誤差。

4.2 描述子與SVM分類器實驗結果

實驗過程中，對每個樣本用3種算法從不同的角度描述形狀特征，得到的特征向量之間可能存在信息冗余。但之所以使用3種方法更重要目的是將特征向量間的信息缺陷進行互補磨平。

通過混淆矩陣可以得到如下精度表（表4）：

表4 描述子與SVM分類器實驗精度表Table 4 Experimental accuracy of descriptor and SVM

5 水樣測試結果

5.1 圖譜庫識別精度表

通過已建立的赤潮藻類圖譜數據庫，對福建南部海域4個站位的浮游植物網樣進行篩選歸類，每個樣品選擇300個清晰圖片樣本進行分析（不到300個樣本數則全選）。得出識別精度結果如表5所示，可看出特征形態明顯的藻類識別精度較高，反之較低。

表5 圖譜庫識別精度表Table 5 Accuracy of Library Recognition

5.2 圖譜庫篩選結果與顯微鏡結果比對

選取2個福建南部海域站位的浮游植物網樣，每個樣品分別測試3次，用圖譜庫對幾種相應的浮游植物優勢種進行篩選歸類輸出圖譜庫篩選結果，與相應的顯微鏡結果進行比對（表6）。

圖譜庫篩選結果與顯微鏡結果的比值變化范圍在32.2%～96.2%之間，可見采用流式細胞攝像系統在計數方面存在較大瓶頸，對浮游植物樣品進行篩選以計算其密度還需要進一步的優化和改進。

表6 圖譜庫篩選結果與顯微鏡結果比對Table 6 Comparison of Library and Microscopy

6 結 論

1）本項目利用流式細胞攝像系統，初步建立了一種能快速檢測和鑒定赤潮生物及其他浮游植物種類的方法，經文獻資料與實驗收集建立了福建南部海域赤潮生物檔案。

使用新建立的檢測方法及構建的福建南部海域赤潮生物圖譜數據庫，能達到快速鑒定的典型赤潮生物至少5種，常見赤潮生物10種，其他浮游植物9種，合計24種基本涵蓋了福建歷史上爆發過的赤潮藻類和常規監測中容易產生優勢種的藻類。

這種新的檢測方法可以作為福建南部海域赤潮生物鑒定的輔助手段，可在一定程度上減少傳統顯微鏡檢的工作量，并能對所得數據加以分析和總結，有助于提高赤潮應急工作效率，對福建南部海域赤潮災害應急監測與預警預報工作將起到積極的作用。

在圖片資源的基礎上進一步探討了形狀特征描述子，從不同角度描述了藻類的形狀特征，為后續系統的擴展算法提供另一種有效途徑。

2）對于直徑20μm以下的，和／或無法與其他藻類明顯區分開的（如一個屬內的圓篩藻、角毛藻等），最多只能定性到屬，而無法到種；由于同屬種類形態特征相似無法區分識別，故在福建南部海域曾發生過赤潮的種類——角毛藻屬（聚生角毛藻、柔弱角毛藻、旋鏈角毛藻等）與海鏈藻屬（諾氏海鏈藻、細弱海鏈藻等）等藻種已建庫備用，暫未投入應用分析。

3）目前的赤潮圖譜數據庫還有待完善，截止課題完成，圖譜庫中24種藻種的有效樣本合計已達4萬余個，初步滿足赤潮藻類分析的要求。但通過流式細胞攝像技術來識別赤潮藻類只能作為輔助技術，要將該技術業務化還需今后大量的分析研究：需要繼續增加藻類水樣的分析以獲得更多的圖譜豐富數據庫，并在此基礎上廣泛全面的開發其他的形狀特征描述子，如：Sobel算子在像素加權的特點、Canny算子在邊緣分割的優勢、Laplacian算子增強高頻又能保持低頻不變等，這些都是很有特點且行之有效的圖形分析方法；而近年自主智能學習算法的實際應用（如谷歌的虛擬腦技術）更是將圖形分析上升到一個新的高度。

如何有效避免目前已有技術的局限性，尋求更全面的解決方案應用于赤潮藻類識別分析，開發出更準確的運算描述方法是實驗室未來的發展方向。

致謝：本研究的完成得到導師及廈門大學信息與技術學院王博亮教授的指導，并提出寶貴意見，在此表示真摯的感謝。

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