抗核抗體檢測策略研究

譚太昌，吳雅娟，騰飛鵬

（1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，成都 610072；2.山西醫科大學，太原 030001）

血清抗核抗體（ANA）是臨床中應用最多的自身免疫標志物，它的檢測對自身免疫性疾病（AID）的診斷和鑒別診斷具有重要意義。目前，除了用“金標準”間接免疫熒光法（IIF）檢測 ANA 外［1］，國內外的許多實驗室還采用了一些檢測特異性自身抗體的方法，如酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫印跡法、自身抗原微點陣法［2］等。但是由于各個醫院實驗室的規模和患者流量不同，許多實驗室常先進行ANA檢測，只有ANA結果陽性時再進行特異性抗核抗體譜（ANAs）的檢測［3，4］，也有實驗室由于設備和技術原因只開展了ANAs檢測而沒有進行IIFANA檢測。在實際工作中，如果將患者標本同時進行ANA和ANAs檢測，常發現二者結果并不完全相符。本研究將724例臨床住院患者血清標本同時采用IIF檢測ANA和LIA檢測15種ANAs的結果進行比較分析，同時結合臨床診斷探討兩種方法的優缺點，以期能找到一種在臨床上檢測ANA的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2012年10月～2013年3月就診于四川省人民醫院申請自身抗體譜檢測的臨床住院患者標本共計724例，其中男236例，年齡12～86歲；女488例，年齡14～88歲。所有標本同時采用IIF檢測ANA和LIA檢測15種ANAs。AID患者的診斷均符合國際相關學會的診療指南。送檢標本均為待測患者清晨空腹靜脈血，離心10min（3 000r/min）后分離血清在24h內檢測。

1.2 研究方法

1.2.1 IIF檢測ANA 采用德國歐蒙公司提供的ANA（Hep-2/猴肝馬賽克）IIF試劑盒，以人喉癌上皮細胞（Hep-2）和猴肝生物載片按標準程序檢測患者血清ANA。將血清1∶101稀釋后與生物載片反應30min，在PBS緩沖液中浸泡洗滌5min，加入FITC標記的二抗（抗人免疫球蛋白IgG）避光室溫溫育30min，后在PBS緩沖液中浸泡洗滌5min，加甘油封片，由專業人員在熒光顯微鏡下觀察熒光模型，判讀結果，以抗體滴度≥1∶100為陽性。如有混合核型則以主要核型為分析核型。

1.2.2 LIA檢測ANAs 采用德國歐蒙公司提供的LIA檢測試劑盒，檢測15種ANAs：抗nRNP、抗Sm、抗SS-A、抗 Ro-52、抗SS-B、抗Scl-70、抗 PMScl、抗Jo-1、抗CENP-B、抗PCNA、抗dsDNA、抗核小體、抗組蛋白、抗核糖體P蛋白和抗線粒體抗體－M2亞型。第1次血清溫育是將1∶100稀釋后的患者血清1.5mL加入放有膜條的溫育槽中，在搖床上室溫溫育30min，用1.5mL清洗緩沖液洗3次（5min/次）；第2次酶結合物溫育是在槽中加入1.5mL已稀釋的酶結合物（堿性磷酸酶標記的抗人IgG）于搖床上室溫溫育30min，用1.5mL清洗緩沖液洗3次（5min/次）；第3次底物溫育則是加入1.5mL底物液后室溫溫育10min，用蒸餾水洗3次（1min/次）終止反應。最后用臺式掃描儀（CANON）掃描膜條，用EUROLineScan軟件判讀結果：著色強度灰度值≤5為陰性；6～10為可疑；≥11為陽性。如檢測結果出現多個靶抗原陽性，則以最強陽性結果納入分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析。率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AID組及非AID組中IIF、LIA檢測結果分析

表1 IIF與LIA結果不一致分析

表2 IIF與LIA結果一致分析

由表1可看出AID組中IIF陽性占到86.96%，非AID組中IIF陽性也占有很大比例（71.16%），差異有統計學意義。但臨床實踐中要通過IIF來區分AID及非AID是不可能的。表2可看出同時用IIF與LIA檢測ANA，結果均是陽性時診斷為AID的占到79.41%，同是陰性診斷為非AID的有94.33%。IIF與LIA相結合就可以區分AID及非AID。

2.2 IIF、LIA檢測結果與臨床診斷相結合分析

表3 AID組

表4 非AID組

從表3中可以看出，IIF與LIA檢測結果不一致時診斷為RA的比率較高，其中IIF（＋）LIA（-）的診斷中RA占76.25%。而IIF與LIA結果一致時，診斷最多的是SLE。從表4中可看出之所以非AID患者也可檢測出ANA可能與自身條件有關，以患有2型糖尿病和（或）高血壓的患者居多。

3 討論

ANA是一組將自身真核細胞的各種細胞核成分作為靶抗原的自身抗體的總稱，主要存在于血清中［5］，是臨床診斷AID重要的自身抗體。目前常用IIF作為總的ANA篩選試驗。熒光顯微鏡下標本的檢測不僅可使臨床醫生了解血清中是否存在ANA，并可獲知不同抗體所呈現的熒光模型。陽性熒光模型可提示參與反應的細胞核抗原定位，并有助于鑒別診斷。但要明確自身抗體的靶抗原就必須作進一步的ANAs檢測，免疫印跡法［6］可能是目前對ANAs檢測最可靠的實驗室研究方法。它操作易于標準化、簡單快捷，結果判讀方便，一次可檢測AID相關的多種特異性自身抗體，且有較高的敏感性和特異性。但在臨床檢測過程中，我們發現IIF檢測ANA與LIA檢測ANAs的結果不完全相符。本研究對724例檢測結果結合臨床診斷進行分析探討。

表1、表2的研究結果表明262例AID患者組中，IIF（＋）有215例（82.06%），LIA（＋）有147例（56.11%）；462例非 AID患者組中，IIF（＋）有167例（36.15%），LIA（＋）有76例（16.45%）。說明IIF作為臨床診斷AID最常用的篩選方法，敏感性較高；而LIA檢測ANAs有較好的特異性。但二者各有其局限性：1）IIF由于采用的Hep-2細胞抗原底物存在分布不均［7］、含量過低以及不同固定方法對特定抗原的破壞等；其熒光染色不穩定、滴度判斷需系列稀釋、熒光類型有賴于肉眼判斷、少見的特殊類型需專業技術人員鑒定［8］，均可導致采用IIF出現漏檢或誤檢，且IIF對診斷沒有特異性，健康人群中發現用IIF法ANA陽性檢出率可達5%。2）LIA因為檢測膜條上包被的抗原有限，我們使用的試劑膜條上只有15種特異性靶抗原，而已知的與疾病相關的自身抗體已有幾十種甚至上百種（比如抗核仁型的抗體有抗原纖維蛋白、U3-RNP、NOR90、B23、RNAPⅠ～Ⅲ、Th/To、PM-Scl等，而膜條上只包被了PM-Scl和ScL-70），且膜條上一般也沒有針對胞漿纖維的靶抗原，可見LIA只能檢測有限的抗體，漏檢率也很高。

由表3可看出IIF與LIA結果不一致的92例AID患者中有65例是RA患者，占到70.65%，其中51例熒光模型為核顆粒型，3例是核顆粒、核均質型。從RA患者的ANA熒光模式分布可以推測：RA患者血清中總的抗核抗體針對細胞核成分的比例比針對細胞質成分的比例高；3例RA中檢出抗SS-A、抗SS-B等特異性自身抗體；與RA相關的特異性自身抗體也是作為其診斷標志物的有類風濕因子（RF）、抗角蛋白抗體（AKA）、抗環瓜氨酸肽抗體（CCP）等［9］。但RF多采用免疫比濁法檢測，AKA、CCP也沒有被包被于膜條上，所以印跡法檢測RA漏檢率較高。在IIF與LIA檢測結果同為陽性的135例AID患者中54例為SLE，SLE具有自身抗體多樣性［10］，在疾病初期通常為抗一種或少量自身抗原的自身抗體，之后可發展為對很多其他自身抗原或其抗原位點的自身抗體。所以在研究統計過程中會發現，診斷為SLE的熒光模型和ANAs都是多種多樣的，ANAs至少會有一種。

從表4中可看出非AID患者中有很多都可檢測出ANA，也有研究表明，每20個健康人中就可檢出1例ANA陽性［6］。當然這并不是因為IIF和LIA檢測出現假陽性，很多AID是以臨床癥狀出現前數月或數年即呈現自身抗體為特征的慢性疾病，也就是說自身抗體也可以預示疾病的發生、進展和嚴重程度。例如，SLE中抗APL、Ro和La抗體的出現可比臨床診斷提前約3.4年。這些抗體相對抗dsDNA抗體（早于診斷約2.2年出現）和抗Sm及抗核糖核蛋白抗體（早于診斷約1.2年出現）在病程中更早出現［11］，這個概念的重要意義在于預測疾病的可能性。研究發現有很多危險因素形成了“自身免疫易感”人群譜，包括性別、基因、血清學等，這些危險因素與外部環境（如感染、化學因素等）相互作用可能使“潛在自身免疫”變為真正的AID［12］。了解這種潛在性與臨床疾病之間存在時間差異可有助于進行生活方式和藥物治療干預，以預防出現臨床癥狀。為了更有效、經濟地進行AID篩查，有作者建議聯合檢測HLA表型和自身抗體［13］。

綜上所述，因為絕大多數自身抗體針對的靶抗原為自身靶細胞的核成分或細胞膜、細胞漿內物質，所以以 Hep-2細胞作為抗原基質的IIF是篩選ANA的最理想實驗。而LIA具有疾病特異性和較高的敏感性，臨床應用時（尤其是與臨床表現結合高度懷疑AID時）需同時進行IIF篩查ANA和LIA檢測ANAs。但各個實驗室應根據本地區不同的自身免疫性疾病譜選擇ANA IIF加上不同種類的特異性靶抗原組合來進行自身抗體檢測。

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