結直腸癌患者骨髓中survivin基因的檢測及臨床意義

李揚，陳明祥，胡月新

（江蘇省儀征市人民醫院腫瘤內科，儀征 211400）

結直腸癌（CRC）是臨床常見的消化道惡性腫瘤，其發生率僅次于胃癌和食道癌。即使CRC患者病理檢查結果顯示淋巴結陰性，但在術后5年內，多數仍因腫瘤復發、遠處轉移等因素使治療以失敗告終，這可能與血液、骨髓和淋巴結中存在一般方法較難檢測出的微轉移灶有關［1］。作為凋亡抑制蛋白家族（IAP）的重要成員之一，生存素（survivin）特異性表達于多數人的腫瘤組織中，而在正常組織中不表達，因此可作為一種新型的腫瘤標志物［2］。本研究主要探討了survivin mRNA在CRC骨髓中的表達及其臨床意義，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2008年1月～2010年7月本院收治的經病理組織學檢查確診的原發性CRC患者68例，所有患者手術前均未進行過放、化療，其中男38例，女30例；年齡44～83歲，中位年齡62歲；按照2010年國際抗癌聯盟（UICC）標準，Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期27例，Ⅳ期（肝轉移）2例；細胞分化依據Broders分級系統。經患者知情同意和醫院倫理委員會批準，術前抽取髂前上棘處約1mL的骨髓液，通過上海源聚生物科技有限公司提供的淋巴細胞分離液進行有核細胞分離，生理鹽水洗滌后放入-80℃冰箱保存，待測。同時，分別收集同期10例CRC術后的組織標本與10例結直腸良性疾病患者的骨髓穿刺液作為對照。

1.2 方法

選用美國Invitrogen公司生產的Trizol一步法提取細胞及組織的總RNA，并用無RNA酶的DNase清除混雜的DNA，最后采用紫外分光光度計進行定量。具體操作如下：首先取1～2μg總RNA，在70℃條件下預變性5min后，采用日本Takara公司生產的逆轉錄試劑盒進行第1鏈cDNA的合成；其次取4μL cDNA模板進行第1輪聚合酶鏈反應（PCR）擴增，并選取0.5μL第1輪PCR產物進行第2輪的擴增。PCR反應體系主要包含2.5μL dNTP mixture（終濃度為250mmol/L）、2.5μL 10×PCR buffer（含 Mg2＋，終濃度為1.5mmol/L）、Takara公司提供的 0.15μL Taq酶、上下游引物各2μL（20pmol）以及滅菌去離子水補足至25μL，引物序列及反應條件見表1。此外，抽取5μL的第2輪PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并通過凝膠成像系統進行拍照。

表1 巢式PCR引物序列及反應條件

1.3 統計學方法

采用SPSS 10.0統計學軟件分析數據，應用Fisher確切概率法或χ2檢驗進行率的比較，采用Log-rank檢驗或Kaplan-Meier法進行生存分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC骨髓中STC-1表達

68例CRC患者骨髓中，survivin mRNA陽性者共20例。10例結直腸良性疾病患者骨髓survivin mRNA表達均為陰性，10例CRC術后組織標本的survivin mRNA表達均為陽性。典型的骨髓survivin mRNA表達見圖1。

2.2 CRC患者臨床病理特征與骨髓survivin表達的相關性

在CRC患者骨髓中，survivin mRNA陽性表達與臨床分期（P＝0.016）及淋巴結轉移（P＝0.010）密切相關，而與性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤浸潤深度及分化程度等無相關性（見表2）。

圖1 CRC患者骨髓survivin mRNA表達

表2 CRC患者臨床病理特征與骨髓survivin表達的相關性［n（%）］

2.3 骨髓survivin表達與CRC預后的關系

35例患者在術后2年內出現病情進展或復發，其中CRC骨髓中survivin表達陽性的患者平均2年無進展生存期（PFS）為18.3個月（95%CI：17.715～18.964），顯著低于survivin陰性者的21.6個月（95%CI：21.227～21.789）（P＜0.001）（見圖2）。

3 討論

骨髓是腫瘤細胞向靶器官轉移的第二器官或中繼站，通常在早期階段腫瘤細胞便可轉移至骨髓。有研究［3］表明，骨髓中存在的散播腫瘤細胞（DTCs）可能是腫瘤發生局部復發或轉移的根本，因此檢測骨髓中DTCs對于腫瘤診斷、分期、治療及預后判斷均具有十分重要的指導意義。人體的免疫系統可以消除多數DTCs，使其存活數量大大減少。反轉錄酶－聚合酶鏈鎖反應（RT-PCR）因其具有高度敏感性，現已成為臨床上用于檢測微轉移的有效方法［4］。

圖2 骨髓survivin mRNA表達與CRC預后的關系

Survivin作為一種凋亡抑制因子，其作用最強，且主要通過抑制caspase3及caspase7來抑制細胞凋亡，其能有效維持細胞的有絲分裂，促進細胞增殖及血管形成，從而參與腫瘤的發生與發展［2］。Survivin在各種惡性腫瘤組織中的表達會增加，因此可作為腫瘤微轉移的有效標記之一。近年來的研究［5］表明，在外周血、尿液、胸腹水等人體體液中，survivin的檢測具有重要臨床意義，并已獲得廣泛認可。Hernandez等［6］研究顯示，在正常黏膜－結腸腺瘤－腺癌中，survivin的表達依次呈增加趨勢；其在腺癌中的陽性率高達93%，且與腫瘤的分化程度呈負相關。Fang等［7］研究發現，CRC患者survivin高表達表明腫瘤肝轉移及復發的風險有所增加，且患者生存期縮短。最近一項薈萃分析［8］表明，腫瘤組織中的survivin表達可以作為CRC復發及轉移的一項重要判斷指標。施朕善等［9］研究顯示，survivin mRNA在CRC患者外周血中的陽性率為76.7%，其表達與淋巴結轉移及腫瘤分期相關，且行根治手術后survivin mRNA表達明顯降低；行姑息性化療的患者中，有效組survivin mRNA表達水平較化療前明顯降低，而無效組表達升高，提示survivin mRNA檢測對CRC診斷、預后及化療療效的預測均具有一定臨床意義。本研究結果表明，CRC骨髓中survivin mRNA陽性率為29.4%，且與患者臨床分期及淋巴結轉移相關，進一步證實survivin mRNA可作為CRC微轉移的有效標記物。

有研究［10］發現，作為一項獨立的預后指標，微轉移的價值甚至優于腫瘤TNM分期。截至目前為止，國內關于CRC微轉移方面的研究相對較少，且多數均局限于淋巴結的微轉移。因此，本研究為CRC的預后判斷提供了一種新途徑，對于骨髓中survivin陽性的患者，有必要采取積極的綜合防治措施。

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［7］Fang YJ，Lu ZH，Wang GQ，etal.Elevated expressions of MMP7，TROP2，and survivin are associated with survival，disease recurrence，and liver metastasis of colon cancer［J］.International Journal of Colorectal Disease，2009，24（8）：875-884.

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［9］施朕善，康馬飛，李文見.抗survivin抗體與survivin mRNA在結直腸癌患者外周血中的表達及其臨床意義［J］.重慶醫學，2012，41（16）：1575-1578.

［10］Delides A，Maniadakis M，Stathopoulos E.Probabilities ofidentifying a micrometastasis in a cervical lymph node from laryngeal cancer：a stereometric approach［J］.Anticancer Research，2013，33（8）：3213-3216.