LAMP與FQ-PCR技術檢測HBV DNA的特異性和靈敏度比較

鄧正華，晏麗，黃遠帥，彭瑛，溫先勇

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，瀘州 646000）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種引起急慢性肝炎、肝硬化和肝癌的DNA病毒，其感染已成為全世界的一個重要的公共衛(wèi)生問題［1，2］。我國是乙肝高流行區(qū)，目前大約有60%人群感染HBV，10%的人群乙肝表面抗原呈陽性［3］。快速、特異、敏感地檢測HBV，對于早期診斷、觀察抗病毒藥物的療效、篩查病毒核酸和阻斷母嬰傳播等均有重要意義。近年來各種基于免疫學的方法或基于PCR的方法已被用于HBV的診斷檢測，由于各種基于PCR的檢測方法具有較高的敏感性和較好的特異性，應用最為廣泛。FQ-PCR和LAMP技術是在傳統(tǒng)PCR技術基礎上發(fā)展起來的兩種新型體外核酸擴增方法，是目前國際上公認的靈敏度較高和特異性較好的分子檢測方法，已應用到HBV DNA的檢測。然而，目前對于這兩種新型檢測技術在特異性和靈敏度方面的相關報道還比較少。因此，我們在建立LAMP檢測HBV DNA方法的同時，與FQ-PCR方法的結果進行比較，并對它們的特異性和靈敏度進行了比較。

1 材料與方法

1.1 標本來源

經(jīng)瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科檢測確診的HBV復制活躍的病人血清，HPV和EB病毒感染患者的分泌物，經(jīng)細菌室培養(yǎng)、分離、純化的大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌菌落，免疫室用時間分辨技術檢測過的血清免疫標志物為陰性的正常健康人血清標本。

1.2 儀器與試劑

美國 Applied Biosystems公司 Real-time PCR熒光定量擴增儀（型號：ABI7500fast）；美國Bio RAD公司的PCR擴增儀（型號：C1000）；美國Bio RAD公司的凝膠成像儀；普通離心機及高速冷凍離心機；恒溫金屬浴。HBV DNA定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）由深圳凱杰生物工程有限公司提供；DNA擴增試劑盒（LAMP法）由日本榮研化學株式會社提供。

1.3 方法

1.3.1 引物的合成 引物通過查閱參考文獻［4］，由上海生工生物工程有限公司合成，共2對。

內 引 物 為：BIP：5-GATAAAACGCCG CAGACACATCCTCTTAACCTCTCCAA-3，F(xiàn)IP：5-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTTTTGACAA ACGGACCTT-3

外 引 物 為：B3：5-CAAAATTCGCAGTCCCC AAC-3，F(xiàn)3-5-GGTGGTTGATGTTCCTGGA-3

1.3.2 總DNA的提取 取HBV感染患者血清，HPV和EB病毒感染患者分泌物，大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌菌落，正常人血清，使用深圳凱杰生物工程有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取基因組總DNA。在100μL樣本中加入100μLDNA提取液1，振蕩混勻，13 000rpm離心10min，吸棄上清（離心時注意固定離心管方向、盡可能吸棄上清而不碰沉淀）；再加入25μLDNA提取液2，震蕩混勻至沉淀完全溶解，100℃干浴或沸水浴10min，13 000rpm離心10 min，保留上清。如果樣本裂解產(chǎn)物當天不使用，則保存在-20℃中。

1.3.3 LAMP技術檢測HBV DNA方法的建立檢測HBV DNA的LAMP反應體系為：1）樣本反應混合液：2×RM（PH8.8的 Tris-HCL、KCL、MgSO4、（NH4）2SO4、Tween20、Betaine、dNTPs）12 μL，F(xiàn)IP和BIP各4μL，F(xiàn)3和B3各0.5μL，Bst DNA聚合酶1.0μL，F(xiàn)M1.0μL，總體積為23μL。2）質控反應混合液：2×RM12.5μL，PM DNA2.5 μL，Bst DNA聚合酶1.0μL，DW 7.0μL，總體積為23.0μL。再加反應樣品2μL，陽性質控加PC DNA2μL，陰性質控加DW 2μL，總體積為25μL。將PCR擴增儀調至65℃60min；80℃5min后，把上述反應液置于其中反應；反應結束，在凝膠成像儀中直接觀察反應液熒光強度的變化。

1.3.4 LAMP與FQ-PCR技術檢測 HBV DNA靈敏度的比較分析 對同一HBV DNA模板進行10倍梯度稀釋作為擴增模板，待擴增拷貝數(shù)分別為：2.38E7、2.38E6、2.38E5、2.38E4、2.38E3、2.38E2、23.8，2.38copy/mL；分別用 LAMP與FQPCR方法檢測，進行靈敏度比對實驗。

1.3.5 LAMP與FQ-PCR技術檢測 HBV DNA特異性的比較分析 將提取的HBV、HPV、EB病毒、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌以及正常人基因組DNA分別作為擴增模板；分別用LAMP與FQ-PCR方法檢測，進行特異性比對實驗。

2 結果

2.1 LAMP與FQ-PCR技術檢測HBV DNA靈敏度的比較

將同一 HBV DNA（2.38×107copy/mL）以10倍梯度進行系列稀釋，取每一數(shù)量級的稀釋液作為兩種方法的擴增模板。結果顯示：FQ-PCR方法的最低檢測限度為10－5（見圖1），LAMP方法的最低檢測限度達到10－7（見圖2），說明我們所建立的LAMP技術檢測HBV DNA的靈敏度高于FQPCR方法。

圖1 FQ-PCR方法檢測HBV DNA的擴增產(chǎn)物

圖2 LAMP技術檢測HBV DNA的擴增產(chǎn)物

2.2 LAMP與FQ-PCR技術檢測HBV DNA特異性的比較

選擇HBV、HPV、EB病毒、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌以及正常人基因組DNA作為兩種方法的擴增模板。結果顯示：HPV、EB病毒、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌以及正常人基因組DNA用兩種方法檢測均為陰性（見圖3、4）。結果表明LAMP與FQ-PCR技術都能特異地檢測HBV DNA。

圖3 FQ-PCR技術擴增產(chǎn)物

圖4 LAMP擴增產(chǎn)物

3 討論

FQ-PCR技術是目前靈敏度較高、特異性較好、重現(xiàn)性穩(wěn)定的核酸分子定性、定量檢測標準方法之一，克服了傳統(tǒng)PCR技術的假陽性及不能定量等缺點，在病原體測定和基因表達研究等方面有著廣泛的應用前景。但該技術有其特殊的要求：技術含量高，對人員要求也高，需要投入昂貴的儀器，結果的分析也較復雜。鑒于上述原因，F(xiàn)Q-PCR技術不利于在基層實驗室推廣應用，限制了其發(fā)展。因此，如果要讓核酸擴增技術廣泛普及于臨床檢測，特別是病原菌檢測，需要對其進行改造加工。

為了解決上述不足，科學家努力尋求操作更簡便、特異性更強、擴增速度更快的核酸擴增方法。2000年日本學者Notomi等［5］發(fā)明了一種新型的環(huán)介導等溫擴增法（LAMP），短短幾年，該技術已成功地應用于SARS、禽流感、HBV、HIV、瘧原蟲、結核分枝桿菌等疾病的檢測中［6－10］。近年來已逐漸在科研、疾病監(jiān)測與臨床檢測中開展起來，在2009年的甲型H1N1流感事件中，日本榮研化學公司接受WHO的邀請進行H1N1LAMP試劑盒的研制。通過榮研公司近十年的推廣，LAMP技術已廣泛應用于日本國內各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測、食品化妝品安全檢查及進出口快速診斷中，并得到了歐美國家的認同。與PCR技術相比，該技術針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異引物，增強了反應的特異性；不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)，利用一種鏈置換 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在等溫條件下就能完成反應，縮短了檢測時間；擴增產(chǎn)物呈特征性梯狀條帶，加入熒光染料，觀察反應液的顏色變化，直接用肉眼判讀結果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察等過程，操作簡單、方便；不需使用昂貴的熱循環(huán)儀，凝膠電泳和紫外檢測等設備，成本較低，適合于病原微生物的現(xiàn)場快速檢測、戰(zhàn)時野外及基層普及應用。本研究中，建立的LAMP技術檢測HBV DNA，通過大約60min的等溫反應即可檢測到2個DNA拷貝量，靈敏度高于FQ-PCR技術，且都能特異地檢測HBV DNA，根據(jù)以上分析，LAMP技術更適合基層檢測機構的推廣使用。

由于LAMP是一種全新的核酸擴增新技術，對某一基因擴增是否成功受諸多因素的影響，可能還有某些目前所未能發(fā)現(xiàn)的缺陷，筆者認為基因位點的選擇、引物設計的技巧、反應體系的優(yōu)化等方面是今后攻關的重點。相信LAMP在今后的實踐中一定能得到不斷地完善和發(fā)展。

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