他克莫司對小鼠髓樣樹突狀細胞成熟及抗原呈遞的干預作用研究

周艷，楊淑霞，唐海明，楊佩，鄒強，王衍堂＊

（1.四川大學華西第二醫院急診醫學科，成都 610041；2.成都醫學院基礎醫學院免疫教研室，成都 610083）

樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是哺乳動物體內的專職抗原遞呈細胞（antigen presenting cells，APCs），按成熟狀態分為成熟 DCs（mature DCs，mDCs）和 未 成 熟 DCs（immature DCs，imDCs）［1，2］。mDCs能有效激活幼稚 T 細胞（na¨Ive T cells），啟動特異性免疫應答。imDCs則具有較強的吞噬及遷移能力，但因其僅表達低水平的MHC分子以及CD40、CD80和CD86等共刺激分子，imDCs不能有效激活幼稚T細胞，反而誘導T細胞免疫耐受。鑒于DCs的表型和功能具有可塑性，可通過人工干預控制DCs的分化成熟，進而間接調控機體的免疫應答反應。這種干預獲得的imDCs在誘導移植免疫耐受，治療自身免疫性疾病以及變態反應等方面已經取得初步的進展，因此其又被稱為致 耐 受 DCs（tolerogenic dendritic cells，Tol DCs）［3-5］。

他克莫司（Tacrolimus，FK506）是一種強力的新型免疫抑制劑，通過與細胞內FK506結合蛋白（FKBP）專一性結合形成FK506-FKBP復合物，進而抑制鈣神經素（calcineurin）的活性，調控T、B淋巴細胞的活化、增殖以及炎性細胞因子的分泌等［6］。臨床實驗［7］表明，FK506在器官移植以及自身免疫性疾病的治療中發揮著積極的作用。但FK506是否會影響小鼠骨髓來源的樹突狀細胞（bone marrow-derived dendritic cells，BM-DCs）的成熟分化以及抗原呈遞功能，目前尚不清楚。本研究擬通過觀察比較FK506處理后的imDCs，在經LPS誘導成熟后（FK-DCs）的表面分子標志以及功能與未經FK506處理的DCs是否存在差異，探討FK506是否可以誘導小鼠BM-DCs的免疫耐受，從而有助于了解FK506治療自身免疫性疾病以及抑制移植排異反應的免疫藥理學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡雄性SPF級C57BL/6及BALB/c小鼠均購自成都達碩生物科技有限公司，飼養于成都醫學院科研實驗中心SPF動物房。1.1.2 主要實驗試劑 rmGM-CSF及rmIL-4購自美國Perprotech公司；LPS購自美國Sigma公司；FITC標記的抗小鼠CD40mAb，PE標記的抗小鼠CD80mAb，APC/Cy7標記的抗小鼠CD86 mAb，FITC標記的抗小鼠MHC II mAb及相應的同型對照購自美國Biolegend公司；小鼠IL-12、IL-6及TNFα購自美國Perprotech公司；CFSE細胞增殖檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BM-DCs分離培養及藥物干預 取6～8周齡C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死，于75%酒精中浸泡5～10min，無菌狀態下取出脛骨和股骨，浸泡于含1%胎牛血清的PBS緩沖液中。剪刀剪掉骨兩端，用1mL注射器吸取PBS緩沖液刺入骨髓腔反復沖洗，將骨髓沖洗入另一無菌培養皿中，收集培養皿中細胞懸液，離心（300g/min，5min），棄上清，PBS洗滌后搜集細胞。細胞計數后，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，接種于100mm平皿（細胞密度1×106個/mL），加入細胞因子rmGM-CSF 20ng/mL，rmIL-4 10ng/mL，37 ℃，5%CO2孵箱培養。隔日半量換液，去除未貼壁細胞及細胞碎片，并補充細胞因子。培養至第7天，輕輕吹打平皿，收獲輕微貼壁及懸浮的細胞，離心搜集，細胞計數后，重新接種于24孔培養板（細胞密度1×106個/mL），獲得imDCs。加入100ng/mL的LPS刺激24h后，即為成熟BM-DCs。FK506在LPS刺激前24h加入，設2個組，分別為vehicle組和FK506組。

1.2.2 BM-DCs形態學觀察 倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）觀察imDCs、mDCs和FK-DCs細胞形態特征。

1.2.3 流式細胞術（flow cytometry，FCM）檢測BM-DCs表面分子標志 搜集第8天DCs、PBS緩沖液洗滌重懸，調整細胞密度為5×105個/100μL，每組設3復孔，加入CD80、CD86、CD40和 MHC II的熒光抗體標記，4℃孵育30min，PBS洗滌后重懸于300μL PBS緩沖液，以相同熒光標記的同型IgG抗體為對照，流式細胞儀（美國Bd公司）上機檢測。

1.2.4 ELISA檢測BM-DCs培養上清中細胞因子表達 搜集mDCs培養上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-12、IL-6及TNFα的表達水平，每組設3復孔。1.2.5 混合淋巴細胞反應 CFSE細胞增殖測定試劑盒檢測FK506對mDCs刺激同種異型的T細胞增殖的影響。無菌條件下取BALB/c小鼠脾臟，制備脾細胞懸液。注入尼龍毛柱（日本和光公司），37℃，5%CO2孵箱孵育1h，得到純化的T細胞為反應細胞。細胞計數后調整細胞密度為1×106個/mL細胞，加入工作濃度為2μM的CFSE溶液，37℃孵育10min，定時混勻細胞懸液。用等量的含5%FBS的PBS緩沖液中止，離心去上清，PBS洗滌細胞離心去上清，重復兩次。離心重懸后調節細胞密度為1×106個/mL，接種于96孔U型底培養板。搜集培養第8天的mDCs，離心重懸后調節細胞密度為2×106個/mL，加入絲裂霉素C（25ng/mL）滅活，作為刺激細胞。將刺激細胞與反應細胞按不同比例（1∶100、1∶30和1∶10）混合培養于96孔板，37℃，5%CO2孵箱培養72h。離心搜集細胞，流式細胞儀上機檢測。

1.2.6 統計學方法 所有數據采用Graphpad Prism 6.0軟件進行統計學分析，實驗結果用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FK-DCs的形態

光鏡下見培養第8天細胞，mDCs組貼壁生長呈樹突狀，呈梭形及不規則形，FK506組細胞形態未見明顯改變。

2.2 FK-DCs的分子表型檢測

BM-DCs各組 CD80、CD86、CD40和 MHC II表達（見表1）。與vehicle組相比，FK506組mDCs CD80、CD86、CD40和MHC II表達均有明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 流式細胞術檢測FK-DCs表面分子標志（±s，n＝6）

表1 流式細胞術檢測FK-DCs表面分子標志（±s，n＝6）

與imDCs組比較，aP＜0.05；與 mDCs（vehicle）組比較，b P＜0.05

MHC II＋/%CD80＋/% CD86＋/% CD40＋/%imDCs 68.2±2.1 68.8±5.7 24.4±4.8 48.6±5.6 mDCs（vehicle） 98.4±1.7a99.3±2.4a94.7±0.9a72.4±3.5a FK-DCs 79.1±3.5b 82.8±4.6b 79.3±3.7b 54.5±2.9b

2.3 FK-DCs分泌的細胞因子測定

mDCs各組培養上清中BM-DCs各組CD80、CD86、CD40和MHC II的表達水平（見表2）。根據標準品濃度制定標準曲線方程，與vehicle組相比，FK506組 mDCs IL-12、IL-6及 TNFα表達水平有明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 ELISA檢測FK-DCs分泌炎性細胞因子（±s，n＝6）

表2 ELISA檢測FK-DCs分泌炎性細胞因子（±s，n＝6）

與 mDCs（vehicle）組比較，aP＜0.05

IL-12/（pg/mL） IL-6/（pg/mL） TNFα/（pg/mL）mDCs（vehicle） 150.45±19.85 1 680.66±152.19 5 214.23±301.21 FK-DCs 65.27± 9.56a682.33± 89.74a3 829.17±259.21a

2.4 FK-DCs刺激同種異型T細胞增殖能力的測定

C57BL/6小鼠的 mDCs與BALB/c的脾臟T細胞進行混合淋巴細胞反應（見表3）。應用CFSE活細胞標記法，經流式細胞儀檢測后發現，與vehicle組相比，FK506組兩個比例（1∶10及1∶30）的mDCs刺激同種異型T細胞增殖水平有明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

DCs是目前發現的唯一能直接活化幼稚T細胞的APCs，其在誘導T細胞免疫應答或免疫耐受的過程中發揮了十分重要的作用［2］。DCs的表型、成熟度和功能的異質性是平衡免疫反應和免疫耐受的重要因素。mDCs表達高水平的共刺激分子，分泌 T細胞刺激因子（如IL-12、IL-15和IL-18等），選擇激活相應的受者T細胞，從而誘發免疫反應。imDCs表達低水平的共刺激分子，通過T細胞無能、免疫偏離、T細胞凋亡或者誘導Treg細胞產生等誘導特異性免疫耐受［5］。因此，建立大量獲取imDCs的有效方法無疑是Tol DCs臨床應用的前提和基礎。目前常用的獲取Tol DCs的策略主要有免疫抑制劑類藥物誘導、表達細胞凋亡分子、建立細胞因子培養體系、基因工程技術等［8］。盡管誘導Tol DCs的方法較多，在試驗研究中Tol DCs亦顯示出巨大的應用前景，但Tol DCs真正應用于臨床，其誘導手段還需要解決以下問題：1）穩定確切、經濟高效；2）無或低毒副作用以及致畸致癌致突變作用；3）可控性良好，具有良好的優化提高潛力。而目前已應用于臨床的某些免疫抑制類藥物，如阿司匹林、N-乙酰半胱氨酸、環孢素A或地塞米松等均被證實可以抑制DCs分化成熟，發揮免疫耐受誘導的藥理作用。但是以上藥物誘導Tol DCs特異性較差，毒副反應顯著，限制了其在該臨床方向上的研究，尤其在解決自身免疫問題上的長期應用。

表3 CFSE試劑盒檢測FK-DCs刺激同種異型T細胞增殖（±s，n＝6）

表3 CFSE試劑盒檢測FK-DCs刺激同種異型T細胞增殖（±s，n＝6）

與imDCs組比較，aP＜0.05；與mDCs（vehicle）組比較，b P＜0.05

mDCs∶na¨Ive T cells 1∶100 1∶30 1∶10 imDCs 2.5±0.2 5.5±0.9 12.3±1.3 mDCs（vehicle） 15.0±1.9a39.9±3.4a48.8±2.0a FK-DCs 7.1±1.8b 16.8±1.2b 23.9±2.1b

FK506是一種新型強效免疫抑制性大環內酯類抗生素，對T細胞有選擇性抑制作用。FK506直接作用于T細胞時，與親免蛋白FKBP結合形成FK506-FKBP復合物，進而抑制鈣神經素（calcineurin）的活性，并降低活化T細胞核轉錄因子（nuclear factor of activated T-cells，NF-AT）的去磷酸化水平，下調的PNF-AT則直接影響IL-2等炎性細胞因子的轉錄［6］。而FK506還可以抑制核轉錄因子κB（NF-κB）活性［9］，而 NF－κB又參與調控DCs表面的 MHC II以及CD40、CD80、CD86等共刺激分子的表達［10］。因此推測，FK506可能會通過干預DCs成熟及抗原呈遞，間接調控T細胞免疫反應。通過實驗研究證實，FK506在體外可以有效抑制LPS誘導成熟的小鼠骨髓來源DCs表面CD40、CD80、CD86和MHC II分子的表達，下調成熟BMDCs IL-12、IL-6及 TNFα炎性細胞因子的分泌水平，降低成熟BM-DCs刺激同種異型幼稚T細胞增殖的能力。因此，FK506在體外可以成功誘導Tol DCs，深入研究藥物（免疫抑制劑）修飾的Tol DCs以及與T細胞反應的相互作用關系將對進一步干預自身免疫性疾病以及誘導移植免疫耐受提供新的解決思路和臨床治療方向。

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