新疆維吾爾族乳腺癌中細胞色素P450 19基因rs10046位點基因多態性與病理免疫組化指標表達狀態的研究

楊亮，李涌濤，齊新，艾司克爾·阿尤甫，徐立坤，朱麗萍

（新疆醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科，烏魯木齊 830011）

1 資料與方法

1.1 臨床資料

搜集2010年10月～2012年7月就診于新疆醫科大學附屬腫瘤醫院的112例維吾爾族初診原發性乳腺癌患者（病例組）和體檢正常的139例維吾爾族健康女性（對照組）。病例組年齡22～71歲，平均（44.45±9.22）歲；對照組年齡25～68歲，平均（45.30±9.60）歲。收集病例組及對照組患者的一般資料、術后病理資料，回顧性分析既往初潮時間、月經史、惡性腫瘤家族史、生育史、哺乳史等與乳腺癌相關的危險因素。

1.2 納入研究的篩選

1.2.1 病例組納入標準 1）組織學診斷原發維吾爾族女性乳腺癌病例；2）入院前無內分泌、放療及化療治療史；3）無其他系統惡性腫瘤病史，排除乳腺癌轉移、有精神疾患或乳癌晚期患者；4）患者知情同意并簽署知情同意書；5）經過醫院倫理委員會批準。

1.2.2 病例組排除標準 1）入院前接受激素治療；2）合并嚴重的心、肺、肝、腎等臟器功能障礙；（3）在新疆地區居住未滿10年。

1.2.3 對照組納入標準 1）體檢健康維吾爾族女性；2）與病例組匹配年齡±5歲；3）經過醫院倫理委員會批準，患者知情同意后采集外周血并簽署知情同意書。

1.2.4 對照組排除標準 1）接受過激素治療；2）既往患有心、肺、肝、腎等臟器病變；3）在新疆地區居住未滿10年；4）懷孕、哺乳期婦女。

1.3 實驗室檢測

1.3.1 材料和試劑 全血基因提取系統購自天根生化科技（北京）有限公司，引物使用上海生工公司提供引物，限制性內切酶（Bsp1286Ⅰ）（10U/μL）為加拿大（Fermentas MBIFermentas）公司提供。

1.3.2 方法 采用含有乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝管抽取病理組與對照組清晨空腹外周靜脈血2mL，編號標記。取全血500μL加入1 000 μL紅細胞裂解液裂解紅細胞，提取DNA，使用紫外分光光度儀測量DNA濃度及OD值。提取DNA置于-20℃冰箱中保存備用。應用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）基因分型法進行CYP19rs10046位點多態性檢測，此位點位于3＇非翻譯區，C→T多態位點。根據參考文獻及GenBank中CYP19基因序列用Primer3.0軟件設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成：上 游 引 物 （Forward）：5＇-CTGGAACACTAGA GAAGGCTGGTCAGTGC-3＇；下游引物（Reverse）：5＇-GTTCTCTGGTGTGAACAGGAGATGAC-3＇，擴增條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，40次循環后72℃最終延伸5min。PCR擴增產物經過2%瓊脂糖凝膠110V恒定電壓下電泳30min分離，Marker所示條帶由上至下分別為 500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp共7條條帶，當PCR產物在202bp處出現特異性熒光帶，表示擴增成功。將擴增產物及SduⅠ（Bsp1286Ⅰ）內切酶取出并置于冰盒內，按反應體系配好分裝至0.2mL PCR管內，加入擴增產物，于37℃恒溫水浴鍋內消化過夜12h后取出，低速離心提取酶切反應產物在80V恒定電壓下電泳80min，電泳位置上有特異性擴增帶的表明相酶切成功。未被酶切開的長度202bp的一條亮帶為TT型，出現172bp和30bp 2個條帶的為CC型，出現202bp、172bp、30bp 3個條帶的為TC型。隨機對選取的部分CYP19基因3種基因型PCR擴增產物進行基因序列測定。

1.3.3 免疫組化指標評價標準 ER、PR染色定位于細胞核。高倍鏡下綜合染色強度和陽性細胞所占比例，用組織學評分（∑pi）計算積分。其中i代表細胞染色深淺，包括0：不顯色或顯色不清；1：淺黃色；2：棕黃色；3：深褐色。P代表將陽性細胞的百分率數值進行半定量分級：不著色為陰性（-）；＜5%為0分：5%～50%為2分；50%～75%為3分；≥75%為4分。積分1～3分為弱陽性（＋），3～8分為中度陽性（＋＋），9～12分為強陽性（＋＋＋）。

C-erbB-2陽性細胞為膜著色，不著色為陰性（-）；著色陽性細胞數＞10%為陽性，其中著色弱且不連續為弱陽性（＋），著色中等部分不連續為陽性（＋＋），著色強且連續為強陽性（＋＋＋）。

Ki-67陽性細胞多數為核著色，呈棕黃色，少數為較弱的細胞質染色；根據切片所選視野中陽性細胞占全部細胞的比例將其分為：陽性細胞數＜10%為陰性（-）；10%～25%為弱陽性（＋）；26%～50%為陽性（＋＋）；＞50%為強陽性（＋＋＋）。

1.4 統計學方法

全部資料用SPSS18.0統計軟件分析操作，各基因型結果進行 Hardy-Weinberg（H-W）平衡法則檢驗，采用χ2進行組間基因型與等位基因型頻率及免疫組化相關性的比較。檢驗水準α＝0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因組DNA檢測結果

紫外分光光度法檢測樣本基因組DNA：251個樣本的平均濃度為566.20ng/μL，平均 OD值1.82。

2.2 CYP19基因PCR擴增產物電泳圖

CYP19基因rs10046片段經引物所擴增后，其產物為202bp，在Marker標記位于第3條300bp和第4條200bp之間并接近200bp有特異性大小的片段產生，保存圖像并記錄（見圖1）。如有未顯現的樣本則記錄編號，分析陰性原因后重復PCR過程，必要時重新提取基因組DNA。

2.3 CYP19基因rs10046位點擴增片段SduⅠ（Bsp1286Ⅰ）酶切結果

未被酶切開的長度202bp的1條亮帶為TT型，出現172bp和30bp 2個條帶的為CC型，出現202 bp、172bp、30bp 3個條帶的為TC型（見圖2）。

圖1 CYP19基因PCR擴增產物電泳圖

圖2 CYP19基因擴增產物SduⅠ（Bsp1286Ⅰ）酶切電泳圖

2.4 PCR產物測序鑒定

隨機選取的CYP19rs10046位點3種基因型PCR擴增產物進行基因序列的測定結果顯示如圖，測序結果中堿基的改變與酶切結果一致（見圖3）。

2.5 免疫組化指標的表達

2.5.1 ER、PR蛋白在乳腺癌組織中表達

2.5.2 Ki-67、Her-2蛋白在乳腺癌組織中表達

2.6 Hardy-Weinberg平衡檢測

SPSS18.0統計軟件進行 Hardy-Weinberg平衡的分析，病例組（χ2＝2.646，P＞0.05），對照組（χ2＝2.092，P＞0.05），病例組和對照組的基因型均符合 Hardy-Weinberg平衡定律（見表1、2）。

2.7 基因型分布

年齡22～71歲，平均年齡為（44.45±9.22）歲，病例組112例中CC型30例，TC型48例，TT例34例，分別為26.8%，42.9%，30.4%；對照組139例中CC型25例，TC型82例，TT型32例，分別為18.0%，59.0%，23.0%，兩組比較差異有統計學意義（χ2＝6.991，P＜0.05），CYP19基因C、T等位基因型頻率病例組為48.2%、51.8%，對照組為47.5%、52.5%，差異無統計學意義（χ2＝0.027，P＞0.05）（見表3）。

表1 病例組Hardy-Weinberg平衡檢測

表2 對照組Hardy-Weinberg平衡檢測

2.8 乳腺癌組織中免疫組化指標與基因多態性的關系

112例標本臨床資料中有92例免疫組化結果登記完整且由2位副高以上職稱病理科醫師判讀結果一致，ER表達陰性的為36例，弱陽11例，中陽13例，強陽32例。PR表達陰性的為40例，弱陽11例，中陽15例，強陽26例。Her-2表達陰性的為27例，弱陽24例，中陽28例，強陽13例。Ki-67結果登記完整的病例為83例，表達陰性的為10例，弱陽13例，中陽12例，強陽48例。

2.8.1 ER表達與CYP19基因多態性 病例組中ER表達在CYP19基因的rs10046位點CC型、TC型、TT型及C、T等位基因中差異無統計學意義（χ2＝5.420，P＞0.05）；在病例組中CYP19基因的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因與ER表達沒有相關性（P＞0.05）（見表4）。

2.8.2 PR表達與CYP19基因多態性 乳腺癌組織中PR的表達在CYP19基因的rs10046位點基因的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因中差異無統計學意義（χ2＝5.7，P＞0.05）；在病例組中CYP19基因的rs10046位點的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因與PR表達沒有相關性（P＞0.05）（見表5）。

表3 基因型及等位基因在病例組及對照組的分布

表4 基因型分布與ER在病例組的表達

表5 PR表達與CYP19基因多態性

2.8.3 Her-2 表達與 CYP19基因多態性 Her-2表達在病例組中CYP19基因的rs10046位點的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因中差異無統計學意義（χ2＝4.276，P＞0.05）；在病例組中CYP19基因rs10046位點的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因與 Her-2表達沒有相關性（P＞0.05）（見表6）。

表6 Her-2表達與CYP19基因多態性

圖3 CYP19基因片段PCR擴增后產物測序結果

圖4 ER蛋白在乳腺癌組織中的表達（×100倍） 圖5 PR蛋白在乳腺癌組織中的表達（×100倍） 圖6 Ki-67蛋白在乳腺癌組織中的表達（×100倍） 圖7 Her-2蛋白在乳腺癌組織中的表達（×100倍）

2.8.4 Ki-67表達與CYP19基因多態性 病例組 中Ki-67表達在CYP19基因rs10046位點的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因中差異無統計學意義（χ2＝2.685，P＞0.05）；在病例組中 CYP19基因rs10046位點的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因與Ki-67表達沒有相關性（P＞0.05）（見表7）。

表7 Ki-67表達與CYP19基因多態性

3 討論

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，其發生、發展相關危險因素主要有家族或遺傳因素、環境因素、生活方式、種族、生育和激素、飲食、吸煙、體質量指數、哺乳等。地區差異、遺傳因素與乳腺癌的發病密切相關。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與乳腺癌的易感性逐漸成為人們研究的熱點。目前CYP19基因SNP與維吾爾族乳腺癌的研究報道少見，維吾爾族乳腺癌較漢族乳腺癌有自身的臨床及病理特點。有文獻［1］報道維吾爾族乳腺癌臨床分期偏晚，以Ⅱ期、Ⅲ期為主，且術后病檢淋巴結轉移率較漢族高，提示預后較漢族差，有文獻［2］提示維吾爾族乳腺癌免疫組化指標ER、PR、Her-2、nm23、MDR、LRP及ki-67蛋白表達不存在民族差異。故研究維吾爾族乳腺癌特點對新疆地區乳腺癌防治有重要的意義。

細胞色素P450［3］是能夠影響雌激素轉化生成及代謝的物質，分子量為53KDa或49KDa，是由CYP19基因編碼，其基因位于人15號染色體q21.1，由9個外顯子組成，本研究選取的多態位點是在3＇-端非編碼區的rs10046位點，存在C-T單核苷酸的多態性［4］。由于CYP 19基因上的單SNP可以催化雄烯二酮和睪酮激素分別轉化為雌酮和雌二醇［5－7］，是雌激素生物合成中的關鍵酶和限速酶，使雌激素的合成受到影響，從而調控雌激素的水平。

CYP19基因所編碼的酶為雌激素酶合成關鍵，ER（雌激素受體）和PR（孕激素受體）是近年來乳腺癌研究最多的指標，在乳腺癌的發生發展和預后過程中，為敏感指標，因此CYP19基因多態性在相關雌激素受體表達上可能有一定的相關性。國內研究［8］則表示CYP19A1攜帶等位基因與ER、PR相關，其中T等位基因可增加ER表達陰性的乳腺癌的發病風險，尤其是絕經前的婦女表現明顯。但本研究中rs10046位點多態性未發現TC、TT基因型與ER、PR表達的關系。研究結果顯示CYP19基因rs10046位點多態性與對照組的分布存在差異。人類基因多態性在闡明人體對疾病的易感性與耐受性、疾病臨床表現的多樣性以及對藥物治療的反應性上都起著重要的作用。基因多態性與臨床表型的研究可以闡明基因型與表型之間的聯系，在疾病的發生、發展及轉歸等方面也有重要的作用。根據基因多態性的特點用藥，將會使臨床治療符合個體化要求。研究探討該基因多個位點基因多態性與維吾爾族乳腺癌的關系，為個體化治療乳腺腫瘤提供理論基礎。

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