幽門螺旋桿菌細胞毒素相關蛋白A真核表達載體的構建與表達

萬小勇，楊登元

（1.南京市市級機關醫(yī)院消化內(nèi)科，南京210018；2.南京市市級機關醫(yī)院普外科，南京 210018）

幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是慢性胃病（慢性胃炎、消化性潰瘍）的重要病因，Hp感染是導致胃癌發(fā)生的重要危險因素，對人類健康構成嚴重危害［1－3］。Hp是一種微需氧革蘭陰性螺旋桿菌，定植于人胃黏膜上皮細胞表面，在全球人群中的感染率超過50%，某些發(fā)展中國家和不發(fā)達地區(qū)感染率超過90%［4］。

細胞毒素相關蛋白 A（cytotoxin-associated protein，CagA）是由Hp相應的CagA基因編碼產(chǎn)生的一種外膜蛋白，是Hp的重要毒力因子之一，與HP致病及相關疾病臨床嚴重程度有關［3，5］。CagA蛋白具有較強的抗原性，大多HP感染者外周血中可檢出CagA抗體，故其可為HP感染的特異性指標。有研究者［6］在表達Hp CagA蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠實驗中獲得了CagA致癌的直接證據(jù)，但其致癌分子機制尚不明確。

本研究從胃炎及消化性潰瘍患者胃黏膜活檢標本中分離HP，構建了CagA基因真核表達系統(tǒng)，建立了相應的檢測方法，并對CagA蛋白進行分離、純化和鑒定，為進一步的動物實驗、CagA蛋白功能以及致病機制研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

限制性內(nèi)切酶Bgl 2、Xhol1、T-4DNA連接酶（Fermentas公司），DNA膠回收試劑盒、基因組DNA提取試劑盒和質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（TaKaRa公司），DNA Marker和預染蛋白 Marker（Fermentas生物工程公司），一抗：鼠抗CagA多克隆抗體（abcam 公司），二抗：辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋生物技術公司），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司），PYL培養(yǎng)基（法國BioMerux公司），pEGFP 真 核 細 胞 表 達 載 體、Opti-MEM、DMEM-1000培養(yǎng)基（Gibco公司），基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）；長序列、高保真PCR試劑盒（德國羅氏公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 HP菌株的分離培養(yǎng)

胃鏡下已確定為消化性潰瘍或慢性胃炎者，用無菌活檢鉗于胃竇部大彎側(cè)取患者胃黏膜組織做快速尿素酶試驗。尿素酶試驗呈陽性者，將活檢的胃黏膜組織塊研碎后直接接種在PYL培養(yǎng)基表面，37℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)96h，經(jīng)生化反應（快速尿素酶試驗和氧化酶試驗）和血清學鑒定后，擴大培養(yǎng)，收集細菌。

1.3 Hp基因組DNA的提取

收集細菌，PBS洗滌3次，參照試劑盒使用說明提取Hp基因組DNA，待PCR擴增用。

1.4 引物設計

根據(jù)GeneBank中報道的Hp CagA基因序列（AF289450.1），設計上下游引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列如下：

引物序列下劃線部分為酶切位點，分別是Xhol 1（CTCGAG）及Bgl 2（AGATCT）。預期擴增產(chǎn)物長度約為550bp左右。

1.5 RT-PCR擴增Hp CagA基因

以提取的Hp基因組DNA作為模板擴增CagA基因，RT-PCR體系參照試劑盒使用說明。RT-PCR反應條件為：52℃30min，95℃變性15 min，然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶并回收。

1.6 重組pMD18-T-CagA質(zhì)粒的構建

膠回收產(chǎn)物與pMD18-T Simple Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂板過夜，挑選單個菌落擴增，抽提質(zhì)粒進行PCR及雙酶切鑒定，將陽性重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-CagA質(zhì)粒。

1.7 真核表達載體pEGFP-CagA的構建

Xhol 1和Bgl 2分別雙酶切pMD18-T-CagA與pEGFP質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后連接酶切產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂板后挑取單個菌落培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒進行PCR及酶切鑒定，鑒定為陽性的重組載體進行基因測序分析，測序正確的質(zhì)粒命名為pEGFP-CagA。

1.8 真核表達載體pEGFP-CagA轉(zhuǎn)染293T細胞

10%胎牛血清（FBS）的DMEM常規(guī)培養(yǎng)293T細胞，37℃，5%CO2。轉(zhuǎn)染前1d收集2×106細胞接種于8mm平皿中，培養(yǎng)18～24h，使平板中細胞匯合達70%左右。將pEGFP-CagA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，步驟如下：將培養(yǎng)液換為無血清DMEM，在離心管 中 加 入 200 μL 的 Opti-MEM、10 μL Lipofectamine 2000和5μg質(zhì)粒DNA，充分混勻，室溫放置30min。加以上混合物至平皿，37℃孵育4h以上，換10%FBS的DMEM-1000培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染同時另設空白對照和空載體轉(zhuǎn)染對照組。

1.9 Western blot鑒定表達

轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)48h收集細胞。SDS-PAGE蛋白電泳后，將蛋白從轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉。一抗為1∶1 000鼠抗CagA多克隆抗體，二抗為1∶5 000HRP標記的兔抗鼠IgG。用化學發(fā)光蛋白免疫印跡法（ECL）進行 Western Blot顯色分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增Hp CagA基因的鑒定

CagA基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在約550bp處可見單一特異性條帶，大小與預期的結(jié)果一致（見圖1）。

2.2 重組pMD18-T-CagA質(zhì)粒鑒定

通過T-A連接原理將PCR產(chǎn)物與pMD18-T Simple Vector進行連接，產(chǎn)物pMD18-T-CagA 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑4個單克隆進行PCR鑒定，結(jié)果全部為陽性（2-5）（見圖2），取其中1個陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒，Xhol 1和Bgl 2雙酶切，酶切后電泳鑒定可見約550bp左右的目的帶（見圖3）。結(jié)果表明CagA基因片段正確克隆到載體pMD18-T上。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析

圖2 pMD18-T-CagA基因片段的PCR鑒定

圖3 pMD18-T-CagA雙酶切鑒定

2.3 真核表達載體pEGFP-CagA鑒定

pMD18-T-CagA酶切回收后與pEGFP載體相連，將連接產(chǎn)物pEGFP-CagA轉(zhuǎn)化為大腸桿菌TDH5α感受態(tài)細胞。挑取5個單克隆進行PCR鑒定，結(jié)果4個為陽性（2，3，5），1個為陰性（4）（見圖4）。取其中1個陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒用Xhol 1和Bgl 2雙酶切，雙酶切后，電泳鑒定可見2 000bp左右的載體條帶和550bp目的條帶，大小同預計的結(jié)果相符（見圖5）。將質(zhì)粒送上海生工測序，測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中的CagA基因與GenBank公布的堿基序列一致。

2.4 Western Blot鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果

Western blot檢測轉(zhuǎn)染pEGFP-CagA質(zhì)粒后的293T細胞培養(yǎng)上清，在分子量約為30KD位置呈現(xiàn)抗原抗體反應，同時空載體組與空白對照組無條帶，提示轉(zhuǎn)染后的細胞能夠表達CagA蛋白（見圖6）

圖4 質(zhì)粒pEGFP-CagA PCR鑒定

圖5 質(zhì)粒pEGFP-CagA酶切鑒定

圖6 Western印跡法檢測pEGFP-CagA在293T細胞的表達

3 討論

全球超過半數(shù)的人持續(xù)感染Hp，大量的流行病學資料［7，8］表明，胃癌發(fā)生率與Hp感染率呈正相關，Hp感染是胃癌發(fā)生的危險因素之一。CagA蛋白是Hp的重要毒力因子之一，在Hp致病機制中扮演重要角色。經(jīng)TFSS系統(tǒng)進入人胃上皮細胞的CagA蛋白被磷酸化，并定位在細胞質(zhì)膜內(nèi)表面，定植于胃上皮表面的Hp通過其特有的Ⅳ型分泌系統(tǒng)將CagA蛋白注入宿主細胞內(nèi)并引起細胞骨架的重構，與多種胞內(nèi)蛋白相互作用，干擾細胞信息傳遞，激活Rho GTP酶、Rac l和cdc 42，活化 NF-κB，激活c-fos和c－jun等原癌基因以及促進細胞因子和炎性因子的釋放，破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，可能導致細胞增生和凋亡的失衡，出現(xiàn)細胞凋亡減少，而增生活躍，增加自發(fā)性DNA復制錯誤的產(chǎn)生機率，同時增加內(nèi)外源性致癌因子致DNA突變的機會，從而促進胃癌的發(fā)生［9，10］。

各國人群中Hp感染率約為50%，發(fā)展中國家超過70%，我國是Hp感染較嚴重的國家之一，且Hp菌株 CagA 的陽性率高達90%［11－13］。CagA 作為重要的毒力基因和潛在的靶標，已成為當前Hp研究的重中之重，其致病的機理較為復雜，活菌及全基因組機制的研究受干擾因素較多，難以控制。本研究旨在探討體外模型中CagA蛋白的功能及其可能的致病機制。本研究從胃炎及消化性潰瘍患者胃黏膜活檢標本中分離HP，參照genebank序列設計引物，用PCR法獲得Hp的CagA基因序列，然后將其克隆到真核表達載體pEGFP中，通過PCR擴增、雙酶切和序列測定等技術證實重組質(zhì)粒構建的準確性，并利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細胞，通過western-blot法證實了細胞中有特異性外源蛋白CagA的表達。本研究成功構建了Hp CagA基因真核表達載體，完成了CagA蛋白體外表達模型構建，為后期建立穩(wěn)定表達CagA的細胞模型和對CagA蛋白功能的進一步研究提供了良好的基礎。

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