LATS2在人結直腸癌中的表達及意義

陶國全 李國新 葛恒發 郭久兵 董漢章 于 仁

(南方醫科大學南方醫院普外科，廣東 廣州 510515)

有調查研究指出我國結直腸癌術后3年內轉移復發率高達80.2%〔1〕。LATS2基因為 LATS腫瘤抑制家族成員，一旦LATS2在細胞表達異常，可能導致腫瘤的發生〔2〕。Nimmo等〔3〕研究發現LATS2在大腸癌等位基因的失衡率最高。因此，LATS2可能與結直腸癌發生有關。本研究擬探討LATS2在大腸癌生長、轉移中的可能機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源 77例結直腸癌標本及30例正常組織標本收集自南京醫科大學附屬淮安第一醫院2010～2011年存檔標本，其中男45例，女32例，年齡35～91〔平均(60.2±24.1)〕歲。按照國際抗癌聯盟(UICC)制定的腫瘤TNM分期標準:I期+Ⅱ期55例，Ⅲ期+Ⅳ期22例;組織學分級高、中、低分化分別為17、46、14例。納入標本的病例術前均未接受放療和化療。另外收集了20例活體結直腸癌及最遠端切緣的腸黏膜組織(術后病理予以證實)。

1.2 免疫組織化學染色 兔抗人LATS2多克隆抗體購自美國sigma公司;兔抗人LATS2抗體及鏈霉親合素-生物素復合物(SABC)試劑盒均購自上海藍基生物有限公司。在樣本組織癌灶和遠端組織進行取材，4%多聚甲醛液固定，常規脫水，石蠟包埋，連續切片2張，切片厚4～6 μm。分別進行蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學染色。嚴格按試劑盒說明操作。

1.3 RNA、miRNA提取及RT-PCR 取液氮中保存組織，利用總RNA提取試劑盒(天根)提取樣本總RNA。PCR反應體系20 μl，cDNA 模 板 1 μl，上 下 游 引 物 各 1 μl，2 × Taq PCR Master-mix 10 μl，用雙氧水(ddH2O)補足至 20 μl。

反應條件:95℃，5 min;95℃，20 min;60℃，20 min;72℃，30 min，循環數26次。取5 μl產物加1 μl 6倍上樣緩沖液上樣，置于含溴乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。用 IPWIN 6.0分析軟件對圖片上每個條帶進行灰度、面積掃描，以β-肌動蛋白(β-action)為內參，半定量LATS2 mRNA水平表達。

PCR反應體系:miRNA RT產物 2 μl，miR特異引物(5 μmol/L)0.5 μl，2 × Taq PCR Master-mix(天根)10 μl，用ddH2O補足至20 μl。如上反應條件，在High Performance Ultraviolet Transilluminator(UVP)凝膠成像系統上掃描，并分析擴增條帶是否符合目的條帶，利用Image J軟件對條帶進行灰度、面積掃描，以U6為內參，半定量miRNA水平表達。

1.4 Western印跡 將保存液中保存的大腸癌及癌旁組織取出剪碎，37℃搖動孵育2 h，洗膜，100℃4 min變性。每條6%SDS-PAGE凝膠泳道上樣60 μg蛋白，以4℃100 V 100 min條件將蛋白轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(MILLIPORE:KOEA2380C)上，LATS2(proteintech，1∶400)4℃過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗(中杉ZB-2301、ZB-2305，1∶5 000)室溫2 h，設內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物，取擴增產物在15 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，分析所測電泳條帶的性質，電泳條帶經Image J軟件處理，目的條帶與內參照條帶的比值代表目的蛋白的表達水平。

1.5 判定標準 細胞膜或細胞質內有棕黃色細顆粒為LATS2蛋白表達陽性，每張切片以陽性細胞百分率和染色程度兩項得分乘積作為最后得分:總計分＜2分為陰性，≥2分為陽性。

1.6 統計學方法 應用SPSS15.0統計軟件進行分析，計量資料組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 LATS2蛋白在結直腸癌中的表達 77例結直腸癌組織中LATS2蛋白表達陽性率為35.1%(27/77)，明顯低于正常癌旁組織65%(13/20)(χ2=6.741，P=0.007)。免疫組織化學結果顯示，LATS2蛋白主要在腫瘤細胞質表達，部分表達于胞核，癌組織中無表達或者低表達。見圖1。

2.2 結直腸癌及癌旁組織LATS2 mRNA蛋白水平比較 癌組織(0.92±0.15)與癌旁正常組織(1.58±0.12)LATSα mRNA表達水平具有統計學差異(P＜0.05)。Western印跡結果顯示，癌旁正常組織組中LATS2表達明顯高于癌組織。見圖2。

圖1 LATS2在結直腸癌和癌旁正常組織中的表達(免疫組化染色，×400)

圖2 LATS2在結直腸組織及正常組織中的表達

3 討論

LATS2基因定位于13q11-q12，有8個外顯子，編碼由1 081殘基組成的蛋白質。LATS基因于1995年在果蠅(Drosophilamelanogaster)中首次發現〔4〕，并且隨后在出芽酵母 (dbf2，cbk1)、裂殖酵母(orb6)、線蟲(cLats)、鼠(Lats1，Lats2)以及人類 (LATS1，LATS2)均發現了保守的同源基因〔4～6〕。大量研究證明，人LATS2與白血病、肺癌、乳腺癌、食道癌等惡性腫瘤發病相關，這些研究結果提示LATS2在腫瘤發生過程中可能扮演重要的角色。相關研究表明LATS2 mRNA和蛋白的表達水平與癌的惡性程度呈負相關，LATS2的低表達可能參與癌的發生、發展及浸潤轉移過程，證明LATS2基因對預測癌的病情進展、靶向治療和早期病變篩查具有一定的意義〔7〕。

Sivarajasingham等〔8〕利用免疫組化和PCR分析了23名患者的結直腸癌標本，結果顯示13q11.2-11區域的等位基因失衡率最高，而此區也是LATS2基因所在區域，因此LATS2可能與結直腸癌發生有關。本研究顯示結直腸癌石蠟病理切片中LATS2表達明顯癌旁正常組織。綜上所述，本研究證明了LATS2在結直腸癌中呈低表達，可能為潛在的抑癌基因或原癌基因，推斷LATS2可能在癌細胞侵襲、轉移過程中共同發揮重要作用。這種潛在的作用可能為治療結直腸癌復發轉移提供新的靶點，對未來預測結直腸腫瘤預后提供正確評價。

1 汪 路，孟慶勇，王小軍，等.結腸癌根治術后復發轉移危險因素分析〔J〕.中國腫瘤，2007;16(8):646-8.

2 章艷茹，于 珍，邱錄貴.LATS2基因與腫瘤〔J〕.國際腫瘤學雜志，2013;40(1):3-5.

3 Nimmo RA，Slack FJ.An elegant miRror:microRNAs in stem cells，developmental timing and cancer〔J〕.Chromosoma，2009;118(4):405-18.

4 Ji L，Nishizaki M，Gao B，et al.Expression of several genes in the human chromosome 3p21.3 homozygous deletion region by an adenovirus vector results in tumor suppressor activities in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Res，2002;62(9):2715-20.

5 李業霞，曹進能，祁麗花，等.鹽酸吉西他濱對乳腺癌小鼠Tusc2、Lats2基因表達的影響〔J〕.解剖學報，2010;41(6):832-6.

6 姜 政，胡 錦，李新鋼，等.SYBR Green實時定量PCR檢測人腦原發膠質瘤中LATS1和LATS2基因的表達〔J〕.山東大學學報:醫學版，2006;44(12):1289-93.

7 Takahashi Y，Miyoshi Y，Takahata C，et al.Down-regulation of LATS1 and LATS2 mRNA expression by promoter hypermethylation and its association with biologically aggressive phenotype in human breast cancers〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(4):1 380-5.

8 Sivarajasingham NS，Baker R，Tilsed JV，et al.Identifying a region of interest in site-and stage-specific colon cancer on chromosome 13〔J〕.Ann Surg Oncol，2003;10(9):1095-9.