海人酸癲癇大鼠海馬組織的蛋白質組學

李 欣 羅海龍 陳雪寒 楊印東 關亞新

(佳木斯大學附屬第一醫院神經一科，黑龍江 佳木斯 154002)

顳葉癲癇(TLE)約占癲癇發病的40%以上，藥物難以控制。該病病情復雜多樣、發作時間不確定和癥狀表現短暫，難以準確診斷，易出現誤診漏診。蛋白質組學技術實質上是一種雙向電泳(2-DE)診斷技術，作為目前唯一同時檢測大量蛋白復合物定量表達情況的實驗室技術，已得到廣泛性的應用。2-DE與質譜技術相結合在疾病特異性標志物、發病機制和臨床治療等多方面有明顯優勢。本研究采用蛋白質組學技術研究海人酸TLE大鼠海馬組織蛋白質的差異性表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 20只健康Wistar大鼠均購自牡丹江醫學院動物實驗中心，2月齡，體質量為(200±20)g，清潔級，由專人飼養。十二烷基硫酸鈉(DS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)、Sample grinding kit試劑盒、蛋白質定量試劑盒、固相pH梯度干膠條和CyDye染料均購自Amersham Biosciences公司，苯甲基磺酰氟化物購自Sigma公司。

1.2 分組及造模方法 隨機分為對照組和TLE模型組，各10只。模型組選擇戊巴比妥腹腔注射完全麻醉處理后，穩妥予以固定，選擇左側海馬CA3區作為藥物注射點，緩慢注入1 μl體積的海人酸，注射時間控制在5 min內，注射完后將皮膚縫合;對照組采用相同方法，注射等體積的生理鹽水溶液〔1〕。

1.3 海馬組織蛋白提取方法 在癲癇臨床癥狀發作終止24 h后，斷頭處死所有實驗大鼠，徹底分離出海馬組織。研磨處理好海馬組織后，加入一定劑量的腦組織裂解液，繼續研磨1 min，冰上放置10 min，4℃條件下高速離心10 min，吸取上清液在-80℃冰箱里保存備用。各組實驗大鼠腦海馬組織樣品采用Bradford法對蛋白予以定量檢測，按說明書操作。

1.4 蛋白標記方法 吸取50 μg各大鼠海馬組織蛋白樣品置入離心管中，依次加入各種熒光染料工作液，完全混勻后放置在冰上避光反應0.5 h，后加入賴氨酸終止反應。最后加入相同體積的普通裂解液，置于冰上避光反應10 min。

1.5 雙向電泳檢測 海馬組織蛋白樣品定容至450 μl后行等電聚焦處理，后取出IPG膠條放置在5 ml平衡液中烷基化反應15 min。將平衡處理后的IPG膠條置于濃度為12.5%的聚丙烯酰胺凝膠上方，使用溴酚藍和瓊脂糖予以封頂，最后行SDS-PAGE電泳反應，一直到溴酚藍指示線跑至聚丙烯酰胺凝膠底部邊緣時終止電泳。

1.6 掃描及差異點分析 蛋白組織電泳結束后，對聚丙烯酰胺凝膠進行掃描，使用專業軟件對兩組大鼠海馬組織蛋白質的掃描圖像予以分析，表達水平相差超過兩倍者可認為差異點。

1.7 凝膠復染和質譜分析鑒定 采用考馬斯亮藍對所有凝膠進行染色，脫色處理后透射掃描，然后應用分析軟件對凝膠點的差異性予以分析和比較，采集差異性蛋白質點后脫水處理至白色狀，將蛋白組織樣品濃縮處理至0.5 μl，一定時間干燥后在質譜儀上進行分析，獲得圖譜后鑒定蛋白質。

2 結果

TLE大鼠海馬組織中共檢測出15個差異性表達的蛋白質點，其中9個表達上調，6個表達下調，見表1。

表1 海人酸TLE大鼠海馬差異蛋白質譜結果

3 討論

蛋白質組學實驗室技術的檢測目標是蛋白質組，主要分析組織器官或機體細胞內蛋白質組成成分的動態變化情況、蛋白質的表達水平和修飾的具體狀態，進而揭示各種蛋白質成分相互之間的作用與聯系，并且可在整體上探討蛋白質組成和調控等方面的活動規律。疾病在出現臨床癥狀、體征之前，機體某些蛋白質在組織結構、表達水平、修飾方式和相互作用等方面均發生明顯變化。臨床上通過對處于不同狀態下的細胞、體液或器官組織的差異蛋白質進行比較分析，即可辨別出與某些疾病具有高度相關性的特異蛋白質分子，進而為揭示疾病發病機制、臨床診治以及疾病預后評估等方面提供可靠實驗室指標。

海馬組織是人體腦組織邊緣系統的一部分，與日常學習記憶、情感表達波動、應激性反應和老化等均有密切的聯系，是目前多種相關性疾病的研究重點。包含人類在內的多種哺乳動物海馬組織蛋白質的數據庫已陸續建立〔2～4〕。TLE病理特點主要為機體海馬區域的腦細胞組織結構發生異常表現，也稱為海馬硬化表現。臨床上采用外科方式予以治療，大部分癇性發作可得到有效控制。但是海馬硬化表現是導致TLE發生的誘因還是TLE疾病發展的最終結果，目前仍未研究清楚。國外研究人員采用2-DE聯合質譜技術對內側TLE患者海馬區域的蛋白質組學變化進行相關性研究，發現細胞骨架蛋白、載脂蛋白A-I、細胞內酰基輔酶A硫酯水解酶和腦衰蛋白反應介導蛋白-2等表達水平均出現明顯異常〔5～8〕，這些研究發現有利于揭示內側TLE的發病作用機制。本研究共檢測出15種差異性蛋白質在神經細胞損傷、機體能量代謝過程和氧化應激反應等多個方面均發揮著極為重要的作用，證實了海人酸TLE大鼠海馬組織中存在許多差異表達的蛋白質，可能與癲癇的發病機制有關。

1 吳春風，黃松明，鄭 幗，等.海人酸致癇大鼠海馬及腦脊液谷氨酸及天冬氨酸變化的意義〔J〕.實用兒科臨床雜志，2007;22(24):1869-70.

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5 Yang JW，Czech T，Felizardo M，et al.Aberrant expression of cytoskeleton proteins in hippocampus from patients with mesial temporal lobe epilepsy〔J〕.Amino Acids，2006;30(4):477-93.

6 Yang JW，Czech T，Gelpi E，et al.Extravasation of plasma proteins can confound interpretation of proteomic studies of brain:a lesson from apo AI in mesial temporal lobe epilepsy〔J〕.Brain Res Mol Brain Res，2005;139(2):348-56.

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