IL-1β、HIF-1α和VEGF在兔膝關節骨性關節炎模型滑膜中的表達

帥 明 林荔軍 林昭偉 劉云龍 李 奇 (南方醫科大學珠江醫院骨科，廣東 廣州 510282)

骨性關節炎(OA)是中年以上人群中最常見的疾病之一，并且患病人數隨著年齡的增加逐步增多〔1〕。近年來，生物因素尤其是軟骨及滑液代謝介質的研究越來越受到重視〔2〕。本研究探討OA滑膜中的白細胞介素-1β(IL-1β)、血管內皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達與 OA發病的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性新西蘭大白兔30只，月齡6個月，體重(2 000±500)g，由南方醫科大學動物研究中心提供(許可證號SCXK粵2011-0015)。

1.2 儀器及試劑 木瓜蛋白酶購自天津市諾奧科技發展有限公司，活力200萬單位/g。IL-1β與VEGF ELISA試劑盒 (ADL公司，San Diego，USA);鼠抗 HIF-1α 多克隆抗體(Santa Cruz，USA)，山羊抗兔 IgG(H+L)/辣根過氧化物酶(HRP，Jackson，USA)。電泳儀(G42，Biometra，Germany)，標準電源箱(P25，Biometra，Germany)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 健康雄性新西蘭大白兔30只，復合飼料喂養(飼料由南方醫科大學實驗動物中心提供)，飼養溫度20℃ ～25℃，濕度65%，適應喂養1 w后將30只兔隨機數字表法分為6 組，A1、A2、A3 為模型組、B1、B2、B3 為對照組，每組5 只。

1.3.2 模型建立 參照 Muehleman等〔3〕方法，分別于第1、4、7日使用苯巴比妥1 ml/kg體重對兔行耳緣靜脈注射進行麻醉，麻醉后于兔膝關節周圍剃毛，碘伏消毒，關節輕度彎曲于髕腱兩側進針，A1、A2、A3組注入1.6%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml，B1、B2、B3組注入同等劑量的生理鹽水溶液。

1.3.3 標本采集及處理 分別于造模完成后2、4、6 w用氣栓法處死A1和B1，A2和B2，A3和B3組兔子，逐層切開膝關節，觀察標本滑膜、軟骨的大體形態，切取關節滑膜，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，液氮保存，待整組滑膜都切取結束后，置入-80℃冰箱中保存。

1.3.4 酶聯免疫法測VEGF和IL-1β的含量 切割標本后，稱取重量。手工或勻漿器將標本充分勻漿。離心20 min(2 000～3 000 r/min)，收集上清。嚴格按照說明書操作。以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，制作標準曲線，從標準曲線上查出待測標本VEGF、IL-1β含量(ng/L)。

1.3.5 Western印跡測定HIF-1α的含量 0.1 g組織加0.3 ml裂解液(每毫升裂解液加入5 μl PMSF)4℃裂解1 h。4℃12 000 r/min離心20 min，取上清。加入上樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白變性。每孔上樣8 μl總蛋白，15%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯凝膠電泳2 h(濃縮膠電壓80 V，分離膠120 V)。電泳結束后用半干轉移系統將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(80 mA，30 min)。室溫下用含50 g/L牛血清白蛋白(BSA)的Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉2 h，然后分別加入一抗:HIF-1α(1∶500)，4℃過夜。再分別加入相應二抗，室溫孵育1 h。增強化學發光法(ECL)發光試劑盒顯影，以β-肌動蛋白(β-actin)為內參，用Image-Pro軟件分析條帶吸光值。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，數據資料以±s表示，采用單因素方差分析，各組之間采用多重比較LSD或Dunnett多重比較法。

2 結果

2.1 大體觀察 B1、B2、B3組兔膝關節無腫脹、充血，關節液透明，滑膜無水腫、肥厚，關節軟骨呈淡藍色、半透明光滑;A1、A2、A3組兔膝關節腫脹、充血明顯，關節液呈淡黃色渾濁狀態。B1組滑膜稍增厚，軟骨未見缺損，關節面粗糙有小的裂隙且色澤灰暗。B3組滑膜明顯增厚關節面軟骨色澤灰暗、潰瘍形成。A3組滑膜最厚，與股骨粘連嚴重，軟骨缺損明顯，部分軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露。

2.2 滑膜的IL-1β和VEGF的表達 IL-1β、VEGF的表達，A1組＞B1組、A2組＞B2組、A3組＞B3組(均P＜0.05)，模型組中A1組＜A2組、A2組＜A3組(均P＜0.05)。說明IL-1β和VEGF表達隨模型時間的延長而增加。見表1。

表1 各組滑膜的IL-1β和VEGF的表達(± s，n=5，ng/L)

表1 各組滑膜的IL-1β和VEGF的表達(± s，n=5，ng/L)

與A1組比較:1)P＜0.05;與A2組比較:2)P＜0.05;與A3組比較:3)P＜0.05

組別 IL-1βVEGF A1 31.467 3±1.950 0 185.796 6±5.950 1 A2 42.976 3±1.340 11) 208.918 6±5.384 51)A3 47.548 4±1.597 51)2) 246.122 5±6.550 51)2)B1 18.070 0±0.871 21) 141.271 7±5.048 71)B2 18.368 7±0.749 02) 144.652 1±3.568 72)B3 20.131 6±1.060 93) 142.237 5±6.491 23)

2.3 Western印跡測定滑膜中HIF-1α的含量 模型組滑膜中的HIF-1α的含量均高于對照組，A1組〔(0.80±0.05)ng/L〕＞B1組〔(0.40±0.02)ng/L〕、A2組〔(1.08±0.06)ng/L〕＞B2組〔(0.51±0.03)ng/L〕、A3組〔(1.26±0.08)ng/L〕＞B3組〔(0.61±0.03)ng/L〕(均P＜0.01)，且隨模型時間的延長而增加。A1組＜A2組，A2組＜A3組(均P＜0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測滑膜中HIF-1α蛋白的表達

3 討論

OA動物模型的建立有多種方法，如手術、關節制動、藥物注射及自發模型等，其中以藥物注射方法較常用，多采用木瓜蛋白酶注射方式進行誘導。相關研究表明，將木瓜蛋白酶注入兔、豚鼠的髖關節或膝關節腔內可引發迅速進展的 OA〔4～7〕。木瓜蛋白酶可分解軟骨基質中的蛋白多糖，促使其從軟骨中丟失，而OA患者軟骨早期發生的最顯著變化就是水分增加及蛋白多糖減少，故木瓜蛋白酶誘發的OA模型與人體OA類似，是研究OA的較佳造模方法。

由于雌激素對實驗兔OA的發生、發展均有影響〔7〕，故本研究全部選用雄兔進行實驗，以盡可能消除雌激素對結果產生的干擾。本實驗復制的兔膝關節OA模型表現與OA的病理形態學變化一致，說明模型復制成功且A1、A2、A3組病理程度逐漸加重。而模型組OA病理進展過程中滑膜中的IL-1β、HIF-1α、VEGF的表達較對照組明顯增高且呈逐漸升高趨勢，因此可以認為IL-1β、HIF-1α、VEGF過度表達可能是導致病理過程進展的因素。

其可能機制包括:①IL-1β對OA的影響:首先表現為對軟骨細胞的影響，高水平IL-1β與軟骨細胞膜上受體結合將導致復合物增加，進而抑制軟骨細胞合成蛋白多糖、Ⅱ型膠原及細胞增殖，加快軟骨細胞變性而分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原。促進軟骨細胞分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)、一氧化氮合成酶，調控軟骨細胞凋亡;其次表現為對關節軟骨基質的影響，IL-1β導致軟骨基質的主要成分膠原蛋白和蛋白多糖合成受阻，另一方面對基質蛋白多糖的消化增加，并由此引發基質水分喪失，軟骨細胞不能從基質中獲得充分營養，自身功能受損，出現基質形態與軟骨細胞功能間的惡性循環;并且IL-1β對軟骨細胞具有旁分泌和自分泌作用，能進一步促進OA病程迅速發展。②HIF-1α的影響。在常氧條件下HIF-1α經蛋白酶體降解，這種酶解呈氧依賴性，因此缺氧狀態下HIF-1α的降解受阻并最終易位到細胞核與HIF-1β二聚化，組成有活性的HIF-1，調節多種靶基因-缺氧反應基因，如 VEGF、EPO 等的轉錄和表達〔8，9〕。Yudoh等〔10〕發現代謝壓力和氧壓力都可以誘導OA患者關節軟骨細胞中HIF-1α基因的表達，HIF-1α mRNA在衰退區域的表達比未衰退區域增多，缺乏HIF-1α基因的軟骨細胞無論在常氧和缺氧條件下均不能產生能量和合成基質，并且代謝應激誘導的細胞凋亡加快。③新生血管的形成是關節破壞發生發展的一個重要環節，新生血管的大量形成和滑膜的不斷增生逐漸形成具有侵襲性的血管翳，使得關節侵襲受損而致殘。VEGF是目前發現的促進血管生成的最重要因子，能特異地結合血管內皮細胞，促進內皮細胞生長，增加血管通透性，從而促進內皮細胞生長，增加血管通透性，從而促進血管生成〔11，12〕，其表達主要受HIF-1α 調控〔13〕。

本實驗提示IL-1β能抑制軟骨細胞合成蛋白聚糖及細胞增殖。IL-1β表達上升的同時伴隨著HIF-1α表達增高，即IL-1β可以誘導和刺激關節軟骨中的HIF-1α的表達。而VEGF與OA密切相關，VEGF可以在骨關節炎軟骨中表達，隨著OA嚴重程度增強而增多，并且在骨關節炎的進程中受到HIF-1α基因的調控。HIF-1α可以誘導OA中VEGF的表達，調節VEGF對組織缺氧的反應，表現為VEGF表達亦增高，說明了IL-1β、HIF-1α、VEGF與OA的相關性。

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