銀杏葉(舒血寧)聯合電針對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用

律泉明 張大威 李一帆 (敦化市醫院神經外科，吉林 敦化 33700)

缺血性腦血管疾病約占腦血管疾病的70% ～85%〔1〕。腦缺血疾病的癥狀體征，在中醫屬于“中風-中經絡”范疇，其基本病機有風、火、痰、瘀、虛幾端，而無論是何種病理要素為主，均因絡脈瘀阻，氣血不暢甚或不通而導致腦髓失養、津停血瘀、神機失用〔2〕。美國俄勒岡州立大學醫學系的研究人員在長達3年多時間的臨床研究中發現，65歲以上老年人常年口服銀杏葉制劑可有效預防記憶力退化和阿爾茨海默病〔3〕。研究表明銀杏葉注射液對腦動脈硬化癥引起的腦供血不足有一定的改善作用〔4〕。此外，電針技術在腦血管疾病的預防和治療方面對改善腦細胞供氧、促進腦細胞功能的恢復都起到了重要的作用。本研究創新性地把我國傳統中醫中藥理論與電針針灸技術相結合，探討此聯合治療方案對腦缺血損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 72只體重200～250 g雄性健康的Wistar大鼠，由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供。隨機分為四組，每組18只。局灶性腦缺血(MCAO)模型組:給予相同天數、等體積的生理鹽水，然后做MCAO手術;銀杏葉組:舒血寧注射液(規格:5 ml/瓶，由北京神威藥業有限公司提供)，1.25 ml/kg，腹腔注射，1次/d，連續給藥 7 d，在末次給藥40 min后，做MCAO手術;銀杏葉聯合電針治療組:在銀杏葉組注射給藥的基礎上，MCAO術后2 h，進行電針治療，取頭穴和體穴兩組穴位。頭穴:前庭聰、百會、四神聰、水溝穴(取病灶區)，體穴取肢患側:內關、曲池、足三里。選用長25 mm、直徑0.35 mm的毫針，上海產6805-II型治療儀，頻率1～2 Hz，強度0.3～1.0 mA，以針刺處肌肉輕微抖動為宜，持續15 min，留針15 min。MCAO術后22 h，重復電針1次。假手術組:給予相同天數、等體積的生理鹽水，只分離頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，不做MCAO手術。

1.2 大鼠MCAO模型建立 采用改良的Longa方法〔5〕。所有器械經高壓蒸汽滅菌，用10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35 ml/100 g)，將大鼠仰臥位固定于手術臺上，行頸部正中切口，逐層分離并暴露右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，避免刺激迷走神經。在距頸總動脈分叉5 mm處結扎頸總動脈，剪一“V”形切口，將直徑0.20 mm，長2.5 cm的魚線緩慢插入該口，逐漸插入頸內動脈內，向前緩慢推進18～19 mm，稍遇阻力即停止，扎緊頸內動脈，防止出血和魚線滑出，縫合皮膚。術后給以軟飼料喂養，飲水不加限制。各組大鼠均MCAO術后24 h取材。MCAO造模成功的標準:動物手術清醒后有明顯手術對側(即左側)Horner癥(左側眼瞼下垂，眼球凹陷)及手術對側(即左側)偏癱體征(不能完全伸展左前肢，行走時向左側傾倒或轉圈)〔6〕。

1.3 腦組織梗死范圍測定〔7〕MCAO造模后24 h，每組6只大鼠，取出腦組織放入低溫生理鹽水中沖洗，隨即放入-20℃冰箱中冷凍5 min，去除嗅球、小腦和低位腦干，冠狀面切成5片，將切片放入4%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min后置于50%甲醛溶液中避光保存，固定24 h。經TTC染色后，非缺血區呈玫瑰紅色，梗死區呈白色。將白色組織仔細切取稱重，以梗死組織占腦組織總重量的百分比作為腦梗死范圍。

1.4 生化指標測定 實驗各組大鼠6只，MCAO造模后24 h，取右側大腦組織，4℃生理鹽水洗凈，準確稱重后移入玻璃勻漿管中，冰浴條件下，用冷0.9%生理鹽水按1∶10制成10%的腦組織勻漿液，6 000 r/min離心10 min，提取上清，按各試劑盒說明分別進行乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化物(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的測定。

1.5 電生理檢測 MCAO造模后24 h，每組取6只大鼠，進行感覺誘發電位(SEP)和運動誘發電位(MEP)檢測。將受檢大鼠用10%水合氯醛作腹腔麻醉，在頭顱后部，消毒皮膚，切開頭顱后部皮膚，剝離骨膜，用牙科鉆在右側皮層中央后回感覺區相對應的冠狀縫后3 mm，失狀縫旁1 mm處鉆一盲孔;左腿部剪毛，并暴露左腿坐骨神經。用Powerlab誘發電位儀，BL-410生物機能實驗系統，刺激參數:粗電壓，強度3 V，波寬1 ms，頻率10 Hz，增益20倍，濾波300 Hz，時間常數0.01 s，掃描速度6.25 ms/div。SEP時，刺激電極位于坐骨神經，記錄電極置于皮層，負極置于頭皮下參考電極插于椎旁肌，信號計算機連續疊加100次，方能記錄到該誘發電位;檢測MEP時，刺激電極與記錄電極交換，參考電極位于硬腭下。所有大鼠檢測完后測量其潛伏期和峰-峰值，進行統計學分析。

1.6 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行分析，采用單因素方差分析進行組間比較，數據以±s表示。

2 結果

2.1 腦組織梗死范圍 大鼠MCAO術后24 h，假手術組未見腦梗死灶，其他各組大鼠均有不同程度的腦梗死灶;銀杏葉聯合電針組梗死范圍為(5.78±1.63)%;銀杏葉組梗死范圍為(6.86±1.97)%;MCAO對照組梗死范圍為(11.21±2.43)%。其中，銀杏葉組與銀杏葉聯合電針組梗死灶面積百分比與模型組比較明顯下降(P＜0.05)，銀杏葉聯合電針組要優于銀杏葉組，但統計學上未見顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 各生化指標測定結果 大鼠MCAO后24 h，與假手術組相比，其他各組大鼠LDH與SOD活性均降低，以模型組降低最為明顯，銀杏葉聯合電針組高于銀杏葉組;模型組MDA和NO含量均比假手術組增高，銀杏葉聯合電針組數值增高幅度最小，最接近假手術組。見表1。

2.3 電生理檢測結果 模型組已經失去正常波形，銀杏葉組和銀杏葉聯合電針組SEP與MEP的峰-峰值較模型組都有明顯的增加，且潛伏期均有不同程度的縮短，其中銀杏葉聯合電針組優于銀杏葉組。各組之間相比較差異顯著(P＜0.05)。見圖 1，表 2，表 3。

表1 實驗各組大鼠腦組織LDH、SOD、MDA及NO測定結果(n=6，±s)

表1 實驗各組大鼠腦組織LDH、SOD、MDA及NO測定結果(n=6，±s)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別LDH(U/gpro)SOD(U/mgpro)MDA(nmol/mgpro)NO(μmol/gpro)1.35±0.22 61.94±19.33 6.31±1.02 14.51±1.38銀杏葉組 1.98±0.271)109.75±23.961)4.01±1.111)10.68±1.951)銀杏葉聯合電針組 2.04±0.211)128.67±24.151)3.39±1.011)9.82±1.931)假手術組 2.10±0.131)135.54±18.311)3.01±0.861)8.57±1.621)模型組

表2 實驗各組SEP潛伏期與峰-峰值(n=6，±s)

表2 實驗各組SEP潛伏期與峰-峰值(n=6，±s)

與模型組比較:1)P＜0.05;與銀杏葉組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 潛伏期(ms) 峰-峰值(mV)6.34±0.23 0.01±0.01銀杏葉組 5.51±0.301) 0.03±0.011)銀杏葉聯合電針組 3.82±0.161)2) 0.06±0.011)2)假手術組 2.07±0.021)2) 0.15±0.011)2)模型組

表3 實驗各組MEP潛伏期(± s，n=6)

表3 實驗各組MEP潛伏期(± s，n=6)

組別 潛伏期(ms) 峰-峰值(mV)6.64±0.41 3.96±1.23銀杏葉組 5.22±0.321) 10.89±2.291)銀杏葉聯合電針組 4.24±0.141)2) 35.47±1.611)2)假手術組 2.03±0.021)2) 80.65±0.511)2)模型組

圖1 各組SEP及MEP波形

3 討論

銀杏葉是我國特有植物銀杏樹之葉，性味甘、苦、澀、平，有斂肺、平喘、活血、化瘀、祛風、通絡、止痛的功效。中醫認為其具有化痰濕、化淤血、益心肺的作用。目前在臨床上，銀杏提取物及其制劑主要用于治療心腦血管及中樞神經系統病變〔8〕。舒血寧注射液是銀杏葉提取物，主要成分是黃酮和銀杏內酯，具有抑制血小板活化因子，清除自由基，促進血液循環;抑制血栓形成，緩解組織缺血缺氧及組織水腫，抗脂過氧化，抑制炎癥反應等作用。有研究顯示，早期對腦梗死患者應用舒血寧注射液能有效抑制血清可溶性血管細胞黏附分子(sVCAM-1)的表達，從而阻斷白細胞向缺血區的浸潤和遷移，可減輕缺血腦細胞的損害，有利于病情恢復〔9〕。

針刺可以刺激中樞神經系統中內啡肽、復合胺、P物質、降鈣素基因相關肽、神經肽Y等物質的釋放，降低血液黏度，抑制血小板聚集和黏附，抑制紅細胞聚集及降低血球壓積，達到增加腦血流量，改善腦細胞供氧，促進腦細胞恢復功能，激發和改善腦休克。同時在改善二便功能、緩解肢體痙攣、減輕截癱性疼痛等并發癥、后遺癥方面有較好的療效〔10〕。

LDH是一種糖酵解酶，在胞質內含量豐富，當細胞受損或死亡時可釋放到細胞外，所以細胞死亡數目與LDH活性呈正比，由此可判斷細胞受損的程度。MDA是脂質過氧化作用的終產物，在一定程度上間接地反映出細胞損傷的程度。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機體受自由基攻擊的嚴重程度。NO是一種不穩定的高度彌散性自由基，主要通過大量的化學反應而發揮其生物學作用，廣泛影響信息傳導過程，能量代謝和DNA合成。在腦缺血損傷時具有雙重作用，多數研究認為，早期生成的NO由于時間短暫，通過擴張腦血管，增加腦血流，抗血小板聚集及降低細胞內鈣等途徑起到對抗缺血性腦損傷的作用;然而在腦缺血中晚期，梗死灶內的炎癥細胞、巨噬細胞誘導產生大量誘導型NO合成酶(iNOS)，由此造成NO的過度釋放，起著細胞毒性作用〔11，12〕。本實驗結果說明銀杏葉聯合電針能夠抑制腦缺血損傷后的LDH與SOD活性降低，減少細胞死亡數目，降低細胞損傷的程度，這與各MCAO手術組腦組織梗死范圍結果相吻合，銀杏葉聯合電針同樣能夠抑制MDA和NO含量的增高，減小細胞毒性作用，對腦細胞起到了有效的保護作用。銀杏葉聯合電針能夠促進腦缺血損傷大鼠感覺功能和運動功能的恢復。

綜上所述，銀杏葉(舒血寧)對腦缺血損傷能起到一定保護作用，但單獨使用效果欠佳。聯合電針同時應用時，對大鼠MCAO損傷具有良好的保護作用，并能有效促進損傷大鼠感覺功能和運動功能的恢復。

1 梁 雁，吳 泳，梁漢周.奧扎格雷鈉聯合銀杏達莫治療進展性缺血性腦卒中療效觀察〔J〕.中國現代醫生，2010;48(1):41-3.

2 肖 健，祝美珍，肖艷芬.扶芳藤合劑預防給藥對大鼠腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α表達的影響〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2007;5(1):41-2.

3 佚 名.美國修訂銀杏葉提取物質量標準〔A〕.中國質量報，2008;16(8):1-2.

4 王曉玲.不同藥物治療腦動脈硬化癥的療效觀察(附146例報告)〔J〕.貴州醫藥，2008;32(3):223-4.

5 Kimura Y，Sumiyoshi M，Kawahira K，et al.Effects of ginseng saponins isolated from Red Ginseng roots on burn wound healing in mice〔J〕.Br J Pharmacol，2006;148(6):860-70.

6 向秋玲，陳健文，馬仁強，等.三七中人參三醇皂苷對腦缺血的保護作用〔J〕.中山大學學報(醫學科學版)，2008;29(6):705-9.

7 張碩峰，黃賤英，王 晶，等.銀杏內酯B注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.北京中醫藥大學學報，2006;29(12):836-9.

8 方 靜，譚衛紅.來自銀杏提取物的抗腫瘤化合物的研究進展〔J〕.生物質化學工程，2008;42(5):56-60.

9 藥海濱，弓東梅.舒血寧注射液對腦梗死患者血清可溶性血管細胞黏附分子的影響〔J〕.臨床和實驗醫學雜志，2007;6(12):46-7.

10 彭慧淵，陳治忠.針灸治療脊髓損傷的概況和思考〔J〕.針灸臨床雜志，2004;20(1):54-6.

11 Pacher P，Beckman JS，Liaudet L.Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease〔J〕.Physiol Rev，2007;87(1):315-424.

12 Mikkelsen RB，Waraman P.Biological chemistry of reactive oxygen and nitrogen and radiation-induced signal transduction mechanisms〔J〕.Oncogene，2003;22(37):5734-54.