嬰幼兒輔食中細菌總數及蠟樣芽孢桿菌污染情況分析

楊文龍，陳雅蘅，王繼金，劉 勇，周幗萍*

（武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，簡稱Bc）是一種廣泛存在于空氣、土壤中的條件致病菌，也是最常見的食源性致病菌之一，4℃～50℃皆能生長，能引起嘔吐型和腹瀉型2種不同類型的食物中毒。嘔吐型食物中毒是高度穩定的嘔吐毒素（Cereulide）引起中毒，嚴重時能致死，多為儲存不當的碳水化合物食品引起。腹瀉型食物中毒與多種腸毒素（如溶血素Hbl、非溶血性的腸毒素Nhe和細胞毒素CytK等）有關，中毒癥狀相對溫和，多為儲存不當的蛋白質食品引起。中毒主要癥狀是惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、頭暈等，中毒的食物中檢出Bc數量一般在105CFU/g～108CFU/g。Bc能在多種食物中檢測出，如剩米飯、米粉、面粉等淀粉食物，甜點、肉類制品等富含脂類及蛋白質的食品[1]。

從國內外Bc食物中毒死亡案例來看，國外案例幾乎都與未成年人相關，國內大多數案例也涉及到未成年人[2]。在1995年我國湖南省有一個案例報道有多名兒童在食用某多維米粉及全脂營養奶粉后出現嘔吐、發熱、腹瀉等癥狀，其中4名兒童因高熱抽搐死亡[3]，這是我國蠟樣芽孢桿菌食物中毒案例中最嚴重的案例之一。說明嬰幼兒因免疫力低下，對該類細菌中毒更敏感。

Bc的鑒定目前有很大爭議。蠟樣芽孢桿菌群細菌（B.cereus）原來包括了蠟樣芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）、蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）、蕈狀芽孢桿菌（B.mycoides）和假蕈狀芽孢桿菌（B.pseudomycoides）、韋氏芽孢桿菌（B.weihenstephanensis）6個種，2010-2013年又增加了3個新種：B.cytotoxicus[4]、B.manliponensis[5]和B.gaemokensis[6]。由于該群內各種間在基因組上的高度一致，必須采用非常復雜的生理生化反應結合分子生物學技術才能鑒定，加上一些新種的定義還存在很大爭議，要準確鑒定蠟樣芽孢桿菌幾乎成為不可能完成的任務；現行的國家標準GB/T 4789.14—2003《食品衛生微生物學檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗》和食品及藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）標準都未與最新分類系統接軌，同時很多研究者也質疑標準中所采用生理生化法的繁瑣和準確性[7]；同時因為Bc有很多毒素基因，除嘔吐毒素合成相關基因外，都位于基因組內，并廣泛分布在Bc群各種菌株中，所以很多學者在探討食品安全問題時也將Bc群細菌一起討論[8-9]。本研究鑒定的Bc，嚴格意義上僅鑒定到Bc群，排除了蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和假蕈狀芽孢桿菌，但是未區分其他6個種。

本研究從細菌總數和食源性致病菌——蠟樣芽孢桿菌2個指標分析嬰幼兒輔食的微生物污染情況，以期提高嬰幼兒食品的質量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 檢測樣品

市售嬰幼兒輔食，覆蓋高中低檔產品及國內外32個品牌，樣品均購自超市保質期內合格產品，共101份（米粉60份；奶伴侶30份；面條11份）。

1.1.2 培養基

胰酪胨大豆多粘菌素肉湯（trypticsoypolymyxinbroth，TSPB）培養基：胰酪胨17.0g，植物胨3.0g，氯化鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，蒸餾水稀釋至1000mL，pH7.3±0.1；甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂（mannitol yolk polymyxin agar，MYP）培養基：a.牛肉膏1.0g，蛋白胨10g，D-甘露醇10.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂15g，酚紅0.025g（配成溶液加入），蒸餾水稀釋至900mL，pH 7.2±0.1，b.50%卵黃液，c.多粘菌素B 100IU/mL，將a液121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃后加入b液和10mL c液；Luria-Bertani（LB）培養基：胰蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母提取物5g，瓊脂20g，蒸餾水稀釋至1000mL；平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15g，蒸餾水稀釋至1000mL，pH7.2±0.2。

1.2 儀器與設備

GNP-9080隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；YS100正置熒光相差顯微鏡：日本Nikon公司；TC-312 PCR儀：英國TECHNE公司；680X SYNGENE凝膠圖像分析系統：英國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數測定

根據食品安全國家標準GB 4789.12—2010《食品微生物學檢驗菌落總數測定》[10]。

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌的檢測

按照進出口商品檢驗行業標準SN 0176—1992《出口食品中蠟樣芽孢桿菌檢驗方法》[11]，采用最大近似值（most probable number，MPN）法檢測。

1.3.3 ITS PCR檢測

PCR擴增體系：2×TaqPCR Mix 25μL；上下游引物各1μL；DNA模板5μL；加水至50μL。16S～23SrDNA間隔區引物：ITS-16S-1392-S-15（GNACACACCGCCCGT）；ITS-23S-206-A-21（NCTTAGATGTTTCAGTTCVCY），擴增條件：95℃、1min；95℃、45s；55℃、1min；72℃、1min30s；循環30次；后延伸72℃、5min[12-13]。

1.3.4 形態觀察

染色后用顯微鏡觀察有無伴孢晶體排除蘇云金芽孢桿菌；在PCA和LB平板上是否根狀生長，排除蕈狀和假蕈狀芽孢桿菌。再確定蠟樣芽孢桿菌的管數，由MPN表計算蠟樣芽孢桿菌的MPN值。

1.3.5 統計分析

采用SPSS20.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌的鑒定

圖1 部分Bacillus cereus16S/23S rDNA ITS PCR結果Fig.1 Partial result of PCR analysis of 16S/23S rDNA ITS of Bacillus cereus

由圖1可知，炭疽芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌等芽孢桿菌群細菌在進行16S～23S rDNA轉錄間隔區的PCR分析時呈現一致的特征條帶，可以與近緣其他芽孢桿菌區分，成為該群細菌分型和鑒定有力的工具[12-13]。選取在MYP培養基中呈現典型蠟樣芽孢桿菌群細菌菌落特征的菌株進行ITS序列分析。第二道的枯草芽孢桿菌出現了3條亮帶（約為500bp、700bp和900bp），而其他菌株包括Bc標準株均會出現2條亮帶（500bp和750bp），驗證了文獻方法，說明ITS序列分析在鑒別Bc群微生物有效性。通過ITS PCR分析可以將分離株鑒定到Bc群細菌。

圖2 Bacillus cereus鏡檢結果Fig.2 Microscopic examination result ofBacillus cereus

鏡檢觀察分離株菌體為桿狀，成短或長鏈。產芽胞，芽胞圓形或柱形，中生或近中生，孢囊與菌體等寬，未發現伴孢晶體，排除蘇云金芽孢桿菌，圖2為Bc典型株的顯微形態。PCA平板上37℃，培養24h可形成灰白色，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，較大菌落，未發現有根狀生長的特征，排除蕈狀和假蕈狀芽孢桿菌。

2.2 嬰幼兒輔食中菌落總數及蠟樣芽孢桿菌檢測

GB10769—2010《食品安全國家標準嬰幼兒谷類輔助食品》中菌落總數的規定[14]，菌落總數不得超過104CFU/g（mL）。依據此標準，101份樣品中僅30個樣品的菌落總數達標，達標率僅為29.7%，菌落總數的幾何平均數為1.9×104CFU/g。蠟樣芽孢桿菌的陽性檢出率為96.9%（95/98），陽性樣品含菌量在3CFU/g～1100CFU/g范圍內，19個樣品的Bc菌數大于1100CFU/g，幾何均數為350.7CFU/g。

2.3 不同品牌嬰幼兒輔食中細菌總數和蠟樣芽孢桿菌檢測

對32個品牌產品中細菌總數和蠟樣芽孢桿菌含菌量進行比較，有18個地方性小品牌因生產品種單一，采樣數量有限，將其合并列入地方品牌進行對比。

圖3 不同品牌嬰幼兒輔食中細菌總數檢出結果Fig.3 Examination results of total bacterial count in infant formula food of different brand

圖4 不同品牌嬰幼兒輔食中蠟樣芽孢桿菌的檢出結果Fig.4 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food of different brands

經分析各個品牌嬰幼兒輔食中的細菌總數和蠟樣芽孢桿菌檢出情況有顯著性差異（p＜0.05），如伊利、方廣和雅士利等品牌的細菌總數和蠟樣芽孢桿菌含菌量都較低；而酷幼、百氏利臣和小阿哥等品牌產品的細菌總數和蠟樣芽孢桿菌含菌量都偏高。各品牌之間的差異反應了不同的生產商采取的滅菌工藝的不同和過程監控水平的差異。但也須指出，即使是同一品牌的不同批次樣品，其檢出情況也有較大波動，說明每個品牌在生產不同批次的產品時可能因為原輔料、設備和溫濕度等環境因素造成微生物污染水平的波動。從這次檢測分析數據來看，Bc并非嬰幼兒輔食中的優勢菌，其數量占細菌總數的0～7%。

2.4 不同類別嬰幼兒輔食中細菌總數及蠟樣芽孢桿菌檢測

圖5 不同類別嬰幼兒輔食中細菌總數的檢出結果Fig.5 Examination results of total bacterial count in infant formula food of different classes

圖6 不同類別嬰幼兒輔食中蠟樣芽孢桿菌的檢出結果Fig.6 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food of different classes

由圖5和圖6可知，比較配方米粉、奶伴侶和面條3類產品中細菌總數和蠟樣芽孢桿菌數的檢出結果，發現在3種水分活度很低的干粉（或干條快）狀食品中這2項指標均呈現出配方米粉＞奶伴侶＞面條的趨勢。

2.5 不同添加配料嬰幼兒輔食中Bc檢測

市售嬰兒配方米粉配料中維生素和礦物質大多類似，常添加的一些配料來改變口味，不同品牌間同一口味的配料有少許差異，但主要配料類似。根據配方中的配料進行分類比較，不同添加配料Bc檢測情況見表1。

表1 不同配料嬰幼兒輔食中蠟樣芽孢桿菌檢測結果Table 1 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food with different ingredients

由表1可知，無添加口味即原味嬰幼兒輔食蠟樣芽孢桿菌的含菌量為最低，其他有添加配料的樣品Bc都比無添加的高。添加有雙歧桿菌等益生菌的樣品細菌總數最低可能是因為采用的是好氧菌細菌總數測定的方法，厭氧菌不長，檢不出來；同時可能存在拮抗效應導致好氧菌數量下降；但是其復雜的發酵、調配工序增加了Bc污染幾率導致Bc均數偏高，也反應出益生菌的發酵對蠟樣芽孢桿菌沒有明顯的拮抗/抑制作用。一般認為Bc作為土壤中常見細菌容易污染植物性原料，這些植物配料的加入會導致染菌風險上升。但是研究發現添加肉蛋類配方也會導致Bc含菌量的升高，達到甚至高于添加蔬菜和谷物等植物性輔料產品。

2.6 不同貨架期嬰幼兒輔食中細菌總數及蠟樣芽孢桿菌檢測

圖7 不同貨架期嬰幼兒輔食中細菌總數檢出結果Fig.7 Examination results of total bacterial count in infant formula food of different shelf-life

圖8 不同貨架期嬰幼兒輔食中蠟樣芽孢桿菌的檢出結果Fig.8 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food of different shelf-life

所有產品的保質期在14～18個月，由圖7、圖8可知，在貨架期在5個月之前，細菌總數基本穩定有緩慢增加趨勢，蠟樣芽孢桿菌數基本穩定；但到第5個月之后，細菌總數出現下降趨勢，但是蠟樣芽孢桿菌數卻顯著增加。這可能是由于包裝好的嬰兒輔食中水分活度較低，細菌總數穩定，長期甚至可能緩慢下降，可能由于無競爭微生物，食源性致病菌蠟樣芽孢桿菌的數量卻在貨架期5個月后開始大幅度上升。說明如果在產品貨架期內僅用細菌總數來衡量微生物的污染和增殖情況，并推測產品的安全，不僅片面而且有風險。以上幾何均數有統計學意義（p＜0.05）。

3 討論

嬰幼兒免疫力低、食物品種單一，食物中毒風險高，所以嬰幼兒食品的各項安全指標要高于普通成人食品。此次調查結果發現單就細菌總數而言：101份樣品居然只有30份樣品菌落總數達標，合格率僅為29.7%；而且部分超標產品的細菌總數居然達到105CFU/g～106CFU/g。另外，從食源型致病菌蠟樣芽孢桿菌的檢出情況也不容樂觀：樣品中Bc檢出率達96.9%，平均含菌量為350.7CFU/g，19個（19.4%）樣品的蠟樣芽胞桿菌超過1100CFU/g。雖然我國對于嬰幼兒食品中Bc的含量還沒有制定相關標準，但就國際上來說，澳大利亞規定嬰幼兒乳粉Bc含菌量＜103CFU/g；新西蘭對嬰兒食用乳粉要求高，Bc含菌量＜102CFU/g；挪威、愛爾蘭、加拿大（嬰幼兒食品）等限定食品中Bc含菌量＜104CFU/g。

Bc的污染可能來源于原料，還有生產環境和設備。嬰兒輔食主要由大米和奶粉作為主要原料，而這兩種恰恰是Bc污染比較嚴重的食品原料。在Bc食物中毒中有70%的案例都是由米飯引起[15]。本實驗室調查我國市售大米中Bc的污染情況發現80%的大米受到Bc污染，原料奶中最常見的污染菌就是Bc群細菌，噴霧干燥不能完全滅活芽孢，奶粉在包裝等后續工藝中也可能受到后污染，這些芽孢在貯藏、銷售和消費的過程中，一旦條件合適就能生長繁殖產毒[16]。最為危險的是熱穩定毒素Cereulide，一旦合成，后續的任何食品加工工序都無法使其失活[1]。

另一方面食品加工工序越是復雜，越容易受到微生物污染。配料越多、工藝越復雜，往往Bc含菌量越高。研究顯示在Bc可以吸附到不銹鋼材料等設備表面，在生產過程中污染產品[17]。特別是Bc能產芽胞、具有耐熱性，一般食品加工的熱處理和消毒殺菌條件不一定能完全殺滅芽胞。如果企業重視衛生管理和質量監控，加強工藝的優化，保證設備定期清潔，加工過程中將被污染可以大大降低。

作為條件致病菌的蠟樣芽孢桿菌是否會導致嚴重食物中毒取決于3個因素：含菌量；菌株致病力；食用前的加工和保存條件，所以即使是達標產品保存不當也存在一定風險。歐洲食品安全局就特別指出：嬰兒配方食品如檢出致病性的Bc，經溫水調和后如果存放不當可能導致其繁殖并產毒。沖調類嬰兒食品應一次食完，未食用完的已沖調好的嬰兒配方米粉不可放入冰箱冷藏再食用，防止嘔吐毒素Cereulide在室溫和冷藏時合成，如再次食用，即使原含菌量很低的產品也可能因細菌增殖和產毒使抵抗力低的嬰幼兒中毒[17]。

4 結論

市售嬰兒輔食中細菌總數和蠟樣芽孢桿菌污染檢測分析結果表明，101份樣品中只有30份樣品菌落總數達標，合格率僅為29.7%，部分超標產品的細菌總數達105CFU/g～106CFU/g；其中食源型致病菌蠟樣芽孢桿菌的檢出率為96.9%，陽性樣品含菌量在3CFU/g～1100CFU/g范圍內，平均含菌量為350.7CFU/g，19個樣品的蠟樣芽孢桿菌超過1100CFU/g。

我國對于嬰幼兒食品中Bc的含量應盡快制定相關標準，提升嬰幼兒配方食品的質量安全水平，保障嬰幼兒食用安全、放心的食品，這關系下一代健康成長，關系億萬家庭的幸福和國家民族的未來。

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