早期干預對宮內感染致腦損傷仔鼠腦組織NB-3表達的影響①

袁新華，王紅麗，鄧慶先

新生兒發生腦白質損傷受多種因素的影響，但其主要原因是圍生期宮內感染。宮內感染易引起早產，早產兒的主要病理變化為腦白質損傷。研究證實，早期干預可以促進宮內感染致腦損傷仔鼠的神經行為學的改善。

神經黏附分子NB-3是近年發現的黏附分子，屬于免疫球蛋白超家族的Contactin亞家族，集中表達于神經系統，主要表達在神經元的胞體和軸突中[1]。它對中樞和周圍神經元都有作用，可以促神經元黏附以及調節軸突生長；不僅具有軸突導向作用，還可以促進突觸重塑；可以通過促進少突膠質細胞的成熟，進而促進有髓神經纖維髓鞘的形成。本研究探討宮內感染對腦損傷仔鼠腦組織NB-3的表達及其運動功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級成熟Wistar大鼠90只，其中雌性大鼠60只，雄性大鼠30只，體重220～300 g，由佳木斯大學醫學院運動實驗室提供；脂多糖(LPS，血清型055：B5)：美國SIGMA公司；SABC免疫組化試劑盒、抗神經細胞NB-3特定蛋白抗體：北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 動物模型制備與分組

動物室溫(21±1)℃常規飼養、自由飲食，明暗周期各半。環境適應2周后，于17：00以2∶1(雌∶雄)合籠，次日8：00查陰道涂片，以查得精子為妊娠第0天，孕鼠另籠飼養。孕17 d大鼠予0.1 mg/ml脂多糖380 μg/kg腹腔注射，共2 d；或予等量生理鹽水。孕22 d前分娩的仔鼠為早產鼠，去除。仔鼠出生后，取胎盤行HE染色，觀察宮內感染情況，判斷標準為大量中性粒細胞浸潤。隨機選取脂多糖組仔鼠85只，分為干預組(n=40)和非干預組(n=40)；隨機選取生理鹽水組仔鼠40只為對照組。干預組給予豐富康復訓練，對照組和非干預組常規飼養，不給任何干預。1日齡生理鹽水組、脂多糖組各5只取腦組織做病理檢測。1日、7日、14日、21日、28日齡對照組、干預組、非干預組各8只。

1.3 早期干預

1.3.1 早期觸摸 將2日齡干預組仔鼠托至掌心，用毛刷從頭到尾均勻有力刷動，注意不要用力過大，以免產生疼痛。每次20 min，每日1次。同時給予不同強度及頻率的聲音和燈光刺激干預至2周齡。

1.3.2 康復訓練 由于小鼠出生后2周開始睜眼，于15日齡開始給予豐富康復訓練。①豐富環境：每日暴露于豐富環境中2 h，上、下午各1 h。在60×45×45 cm籠內放置不同顏色及形狀的物體，包括轉盤、管道、階梯、搖鈴、秋千、斜坡、杠桿以及不同顏色和大小的圓球等，每周將環境改變2次，以造成新異刺激，第28日齡結束刺激。非干預組和對照組分別飼養于20×30×30 cm標準籠內，不予干預。②平衡木訓練：平衡木長170 cm，寬2 cm，平放距地面7 cm處，讓仔鼠在上面行走，10 min/次。③轉棒訓練：轉棒長150 cm，直徑4.5 cm；中點固定于3 r/min轉動器上，順、逆時針交替轉動，10 min/次。以上每種干預方法至少間隔1 h。

1.4 運動功能評定

對14日齡、28日齡的仔鼠進行懸吊試驗。在自然光的安靜房間內，使仔鼠前肢抓住距離桌面45 cm的水平玻璃棒(直徑0.5 cm)，記錄仔鼠從抓握至掉下的時間。評分標準為：1分：＜10 s；2分：10～30 s；3分：30 s～2 min；4分：2～5 min；5分：≥5 min。

1.5 NB-3檢測

不同日齡仔鼠麻醉下從心耳部位進行灌洗后，迅速斷頭、取腦，將完整大腦置于中性甲醛溶液中固定。各例石蠟包埋組織均取5 μm切片6張，5張行NB-3免疫組化染色，1張用PBS代替一抗作陰性對照。采用SABC法進行組化染色。

光鏡(40×10)下NB-3陽性細胞胞體和軸突周圍為棕黃色。每個大鼠取6張切片，40×物鏡下每個切片取相互不重疊的4個視野，應用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件計算NB-3免疫陽性細胞積分光密度(IOD)。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況

注射脂多糖后，孕鼠的活動、進食均減少，3只提前分娩，5只死亡，其余37只順利生產，共娩出足月活產仔鼠225只，死產仔鼠35只。脂多糖組仔鼠身體顏色青紫、精神萎靡、進食減少、行動遲緩、活動減少、體重低。生理鹽水組孕鼠無異常反應，共娩出足月活產鼠120只，足月仔鼠出生后身體顏色淡紅，反應靈敏，體重正常。

2.2 子宮和胎盤的檢測

脂多糖組孕鼠胎盤可見血管充血、水腫，大量中性粒細胞浸潤。生理鹽水組孕鼠胎盤未見明顯炎癥反應。

2.3 腦組織病理學改變

脂多糖組新生仔鼠腦組織HE染色可見白質、胼胝體、內囊部位組織疏松，膠質細胞聚集，囊間少突膠質細胞減少，腦室內出血、腦白質內血管擴張充血、腦白質內毛細血管破裂出血。對照組新生仔鼠腦組織HE染色可見白質結構完整，布局有序，核淡，核仁清楚。

2.4 神經行為學檢測

14日齡時，與對照組相比，非干預組仔鼠反應遲鈍、活動減少、平衡性差、肌力差、肌張力高，懸吊時肢體自主活動明顯減少，下肢顫抖增多，懸吊持續時間短，測試得分明顯降低(P＜0.01)；對照組測試得分明顯優于干預組(P＜0.01)；干預組測試得分優于非干預組(P＜0.05)。28日齡時，干預組懸吊時間與對照組接近，測試得分無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.5 NB-3表達

1日齡干預組和非干預組NB-3陽性細胞IOD無顯著性差異(P＞0.05)，其他日齡對照組和非干預組NB-3陽性細胞密度值較干預組低。見表2。

表1 各組仔鼠懸吊試驗評分

表2 各組仔鼠腦組織NB-3陽性細胞表達(IOD)

3 討論

大腦的發育過程十分復雜，并且具有其獨特的敏感時期。因此，發育中的大腦比成年大腦更容易受到傷害。在發育敏感期內，機體內部或者外部因素的影響都可能使大腦的發育過程推遲或終止。但中樞神經損傷后具有一定程度的可塑性，可塑性與動物物種、年齡、損傷部位和程度、藥物作用、功能訓練和學習等因素密切相關。因此，尋找可塑性的分子證據對豐富可塑性理論具有重要意義。

豐富康復訓練由豐富環境和一般康復訓練組成，兩者共同作用可以使大腦功能達到最佳恢復狀態。研究證明，不同的康復手段會產生不同的康復效果。廣泛的皮質損傷可使腦組織結構和功能發生改變，對損傷區域的刺激可促進功能恢復。但單純增加力量的訓練并不能誘導腦組織重塑，必須配合技巧訓練[2]。研究顯示，簡單運動方式，如強迫性跑籠訓練僅可促進腦血管生成，而復雜技巧訓練如轉棒和雜技可增加腦皮層突觸數量[3-4]。現己證實，腦區所做任務的多少和任務的性質可以決定樹突分支的復雜性。

豐富康復訓練可以誘導腦缺血周邊區神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、轉化生長因子(TGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等神經營養因子的表達；神經營養因子不僅在中樞神經系統發育過程中對神經元的生存、分化、生長起作用，而且在腦損傷時對神經細胞具有重要的保護作用，并能促進神經細胞功能的恢復[4-5]。

本研究顯示，隨著日齡的增加，腦損傷仔鼠的運動功能均有所改善，早期干預可以進一步提高腦損傷鼠運動功能的恢復。

神經細胞黏附分子NB-3是近年發現的黏附分子，也被稱為contactin-6，是一個糖基磷脂酰肌醇相連的免疫球蛋白超家族的contactin細胞亞群的識別分子，并且明確地表達在神經系統，具有促進神經生長、分化的作用[1,6-7]。Takeda等研究發現，無論NB-3以可溶性形式還是以底物形式存在，都具有促神經元軸突生長的作用，并與NB-3的量成正比關系[8]。Cui等發現，NB-3的表達與少突膠質細胞的發育是一致的，并且可以通過一系列機制促進少突膠質細胞的分化及成熟[9]。NB-3在包括小腦在內的腦的大部分區域都有表達，它的表達在出生后突然增高，并且在小鼠出生后第7天達到高峰，第2～3周進入平臺期，這時神經系統的發育已進入最后階段[6,8]。

本研究顯示，1日齡脂多糖組小鼠NB-3表達較生理鹽水組高，7日齡各組總體表達較1日齡高，14日齡較7日齡低，28日齡更低，這與Lee等的研究結果一致。相同時間段上，干預組較非干預組和對照組腦組織NB-3的表達高。提示，隨著年齡的增長，NB-3的表達增高；早期干預可以進一步提高NB-3的表達，在達到高峰后有所下降，并維持在一定水平上。

本研究顯示，早期干預不僅可以改善腦損傷仔鼠的運動功能，還可以提高神經黏附分子NB-3的表達。由于NB-3具有促神經元黏附及軸突導向作用，在中樞神經系統的損傷修復方面具有一定的意義。早期干預對宮內感染致腦損傷鼠的運動功能的提高，機制之一可能是由于通過提高NB-3的表達來實現的。

我們推測，能誘導NB-3表達增加的因素可能促進腦損傷后神經細胞的修復。神經黏附分子NB-3的表達可能是環境刺激影響發育期腦損傷修復的機制之一。

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