不同穴組電針對局灶性腦梗死大鼠神經行為學及Neurocan表達的影響①

鐘藝華，唐顯軍，李光勤，黃浩然

大量臨床研究證實，中國傳統針刺治療對腦卒中后的神經康復有著積極的促進作用。但不同取穴對療效的影響有待研究。本研究采用在腦缺血損傷后軸突再生、突觸生長、結構和功能重建等方面起重要抑制作用的神經蛋白聚糖neurocan作為觀察指標，比較不同經絡屬性穴位的針刺效應。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠85只，體重200～280 g，由重慶醫科大學動物中心提供。

1.1.2 主要儀器及試劑 SDZ-Ⅱ型電子針灸儀：華佗牌，蘇州醫療用品廠有限公司；RT-PCR技術盒：TAKARA公司；neurocan一抗：SANTA CRUZ生物技術公司；生物素標記山羊抗兔IgG二抗：北京中杉金橋生物技術公司；neurocan SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 用抽簽法將動物分為5組：假手術組(n=5)、模型組(n=20)、水溝-百會組(n=20)、肝俞-腎俞組(n=20)和足三里-曲池組(n=20)。其中模型組和各電針組分別根據缺血時間(即線栓法阻斷血管至取材的時間)分為1 d、3 d、7 d、14 d及21 d共5個亞組，每亞組各4只。

1.2.2 動物模型制備及納入標準 參照Longa[1]等的方法，采用線栓法制備大鼠右側大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。假手術組除不插入線栓外，其余步驟相同。參考Longa的5分制評分標準，在大鼠清醒后進行神經功能評分。0分：無神經功能缺失表現；1分，神經功能輕度缺失：左前肢伸展受限，提尾時屈曲；2分，神經功能中度缺失：爬行時向癱瘓側(左側)旋轉；3分，神經功能重度缺失：爬行時向癱瘓側(左側)跌倒；4分：爬行困難，有意識水平下降的表現。評分1～3分的大鼠納入實驗。在術后1 d、3 d、7 d、14 d和21 d，于大鼠處死前再次進行評分。

1.2.3 穴位選擇 電針組參照華興邦編著的《大鼠穴位圖譜的研制》，根據預先設計，分別取督脈穴水溝、百會，背俞穴肝俞、腎俞和陽明經穴足三里、曲池。水溝：唇裂鼻尖下1 mm正中處，向上刺2 mm；百會：頂骨正中，向后斜刺2 mm；肝俞(雙)：第9胸椎下兩旁肋間，直刺6 mm；腎俞(雙)：第2腰椎下兩旁，直刺6 mm；足三里(雙)：膝關節后外側，在腓骨小頭下約5 mm處，直刺7 mm；曲池(雙)：橈骨近端肘關節外側前方凹陷中，直刺4 mm。用30號1寸毫針刺入穴位，將針柄分別連接在電針儀上，同一輸出電極接同側兩個穴位，采用頻率為20～100 Hz的混頻，疏密波，波寬1 ms，刺激強度以大鼠四肢肌肉輕微抖動，安靜耐受為度。持續30 min，每天1次，均在上午10：00進行。

1.3 neurocan表達

1.3.1 mRNA 按照Trizol試劑盒說明書提取缺血腦皮質組織中總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA濃度。用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA第一鏈：37℃孵育15 min，85℃5 s終止反應，滅活反轉錄酶。引物序列：上游引物：5'-GTG TCA TTG CCT GCC TAT CC-3'；下游引物：5'-GTT ATC ACC TCC TGC TCC C-3'(872 bp)。內參采用GAPDH，上游：5'-TCA ACG GCA CAG TCA AGG-3'；下游：5'-ACC AGT GGA TGC AGG GAT-3'(470 bp)。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35次循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，運用Quantityone凝膠自動成像儀成像，以GAPDH為內對照進行質控和標化，測定目的條帶neurocan/GAPDH的灰度比值。

1.3.2 蛋白 各時間點3.5%水合氯醛1 ml/100 g將大鼠深度麻醉，經左室灌注生理鹽水200 ml和4%多聚甲醛溶液200 ml進行內固定。斷頭，取視交叉前后各2 mm腦組織石蠟包埋，連續冠狀切片。切片常規脫蠟、水化，按照試劑盒提供的實驗步驟進行操作，DAB顯色，光鏡下細胞漿和突起中出現粗細不等的棕黃色顆粒為陽性細胞。用圖像信號采集分析系統分別計數各亞組梗死灶周邊皮質區陽性細胞高表達部位互不重疊的3個視野(10×40倍)下的陽性細胞數，取平均值。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 神經行為學

假手術組無神經功能缺損癥狀；模型組和各電針組術后均出現不同程度的進食減少，體重下降；Longa評分為3分的大鼠往往出現精神萎靡、嗜睡、毛色發黃等癥狀。各電針組與模型組比較，大鼠運動功能在缺血3 d后開始逐漸恢復，7～21 d出現顯著性差異(P＜0.05)；水溝-百會組和肝俞-腎俞組在缺血14 d后Longa評分低于足三里-曲池組(P＜0.05)。見表1。

2.2 neurocan mRNA

模型組neurocan mRNA在缺血1 d后表達逐漸增強，14 d達到峰值，21 d時有所下降，但仍維持高水平表達(P＜0.01)。各電針組在缺血3 d后neurocan mRNA表達均較模型組低(P＜0.05)；并且，水溝-百會組和肝俞-腎俞組在缺血14 d時neurocan mRNA表達較足三里-曲池組低(P＜0.05)。見表2。

2.3 neurocan蛋白

假手術組未見neurocan陽性細胞表達。模型組neurocan蛋白在缺血1 d后表達明顯增強，胞漿、突起中均可見棕黃色顆粒，14 d達到高峰(P＜0.01)，21 d時表達較高峰有所下降，但仍維持高位表達。各電針組在缺血3 d后neurocan蛋白表達均較模型組低(P＜0.05)；其中，水溝-百會組和肝俞-腎俞組在缺血14 d時neurocan蛋白表達較足三里-曲池組低(P＜0.05)。見表3。

表1 各組大鼠各時間點神經功能評分比較

表2 各組大鼠各時間點neurocan mRNA表達比較

表3 各組大鼠各時間點neurocan蛋白表達比較

3 討論

研究表明，中樞神經系統(CNS)損傷后，微環境破壞，能激活星形膠質細胞和其他膠質細胞，在損傷區形成膠質疤痕組織，阻礙神經元再生軸突延伸到遠側端，重建特異性的功能聯系[2]。Neurocan作為與膠質疤痕形成密切相關的分子，是神經組織中一種特異性的硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans,GSPGs)，通過與細胞外基質(ECM)或細胞表面的黏附分子結合，掩蓋或改變其靶分子結構，達到調節神經細胞連接、抑制軸突生長的目的。neurocan在突觸可塑性和神經修復過程中發揮著重要的抑制作用[3-4]。

在左側感覺運動皮質輕中度損傷大鼠模型中，Yi等通過免疫印跡和免疫染色發現，在腦損傷后7 d，neurocan的表達升高，并一直持續到損傷后28 d[5]。在大鼠脊髓損傷(SCI)模型中，Andrews等發現，在損傷平面遠端的脊髓灰質區，neurocan反應性在損傷后7 d明顯升高，到28 d仍維持高水平表達[6]。本研究顯示，neurocan基因和蛋白表達規律一致，均在缺血1 d后表達逐漸增強，14 d達峰后逐漸降低，21 d時仍維持較高水平表達。與上述研究結果基本一致。neurocan對損傷后神經元存活和軸突生長的抑制周期較長，這可能是CNS損傷后軸突不能進行有效再生，導致機體的神經功能修復受限的重要機制之一。

在多種CNS損傷動物模型中，阻斷neurocan功能都能促進軸突再生和運動功能恢復。neurocan功能主要從以下途徑進行阻斷：①抑制neurocan合成：neurocan由核心蛋白和硫酸軟骨素(CS)鏈組成，實驗證明，阻斷核心蛋白或CS鏈與細胞黏附分子的結合，能促進軸突再生[7-8]；②阻斷糖胺聚糖(GAG)鏈：neurocan通過GAG鏈與核心蛋白結合發揮抑制作用，去除GAG鏈能促進再生軸突穿過神經疤痕組織[9-10]。Hill等在大鼠MACO模型的梗死腔內直接注射GSPGs降解酶軟骨素酶ABC連續7 d，發現通過酶解neurocan能降低缺血區膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和提高微管相關蛋白-2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)的免疫反應性，提高神經突延伸，促進運動功能恢復[11]。Yamaoka等發現，p38蛋白激酶抑制劑能降低經表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)處理的星形膠質細胞培養基中neurocan的過表達，促進脊髓損傷后的軸突再生[12]。Jeong等將肝細胞生長因子修飾的間質干細胞(HGFMSCs)移植到C4半切損傷的脊髓中，發現能顯著降低neurocan的表達和GAG鏈的沉積，促進再生軸突穿過膠質疤痕和前爪運動功能恢復[13]。本研究顯示，各電針組在治療3 d后，neurocan mRNA和蛋白表達在各時間點均較模型組下調，運動功能恢復優于模型組，與上述研究發現符合。提示電針促進腦卒中后神經功能恢復的機制可能與下調neurocan有關，這可能是其發揮神經保護作用的機制之一。

傳統中醫學認為，中風病變在肢節，因經絡為邪阻滯，肌肉筋脈失養，導致肢體偏癱。陽明經為多氣多血之經，足三里、曲池為陽明經合穴，針刺該穴位能益氣行血，通經活絡，有助于腦部氣血的恢復[14]。腦卒中病源在腦，而督脈在循行分布上直接入絡于腦，具有調節全身陽經脈氣的作用；因此，臨床上多取具有“醒腦開竅”功效的督脈穴針刺，治療缺血性腦卒中，并觀察到良好的治療效果，且多以水溝、百會配伍取穴，是針刺促進腦缺血損傷后神經功能恢復的常用穴位。此外，也有觀點認為肝腎陰虛是中風根本的病因病機，以補益肝腎為法，取背俞穴中的肝俞、腎俞二穴。本研究比較電針不同穴組的效果，結果顯示，水溝-百會組和肝俞-腎俞組兩者療效相近[15-16]；在缺血14 d時，上述兩組取穴的效果優于足三里-曲池組。不同經絡屬性穴位的針刺效應存在差異，我們考慮與所選擇的穴位分別位于頭部、軀干和四肢，受不同的神經節段支配，其中，督脈取穴和背俞取穴位于腦、脊髓沿線，其刺激信號在向中樞傳導過程中可能更易影響CNS的活動，提示針刺治療中風時存在穴位特異性。

在腦梗死急性期給予穴位電針刺激能下調neurocan的表達，這可能是其促進神經功能恢復的機制之一。不同經絡屬性穴位的針刺效應存在差異。經絡聯合取穴是否能取得更好的療效，有待今后進一步研究。

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