雞蛔蟲COX2和NAD4rDNA的序列測定及分析

李 淼，侯強紅，蔡絲絲，李 奔，李林波，侯利蘭

（1．懷化職業技術學院，湖南 懷化418000；2．湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙410128）

雞蛔蟲屬于蛔目禽蛔科禽蛔屬，是雞體內最大型的一種線蟲，主要寄生于腸道內而引起的一種線蟲病。雞蛔蟲對雞的危害很大，尤其是雛雞，大量成蟲寄生在小腸黏膜時，則會引起腸道堵塞、破裂以及腹膜炎，嚴重感染時可引起宿主死亡。雞蛔蟲病的感染呈世界性分布，主要分布在歐洲、亞洲等地，而在亞洲地區，則以中國部分地區的感染情況較為突出；其他亞洲國家也有感染的病例。

隨著科學技術的發展，分子遺傳學技術在寄生蟲遺傳變異及分類學研究上的應用日益發展，它主要是從DNA水平上研究寄生蟲分類學中的一些問題。在寄生蟲種群中，遺傳變異十分普遍。近年來國內外許多學者利用此類方法來研究雞蛔蟲的遺傳變異及分類問題［1－3］。因此，精確分析寄生蟲的遺傳變異對研究寄生蟲的分類、鑒定及寄生蟲的遺傳結構均具有重要意義。

線粒體基因組具有結構簡單、母系遺傳、缺少重組、進化速率快等特點，特別適合作為遺傳學研究的標記［4－6］。自1962年 Nass［7］等發現 mtDNA 以來，被廣泛用于系統進化分析、比較和功能基因組研究等方面［8］。有鑒于此，本試驗以從湖南等地的雞只所分離的雞蛔蟲作為研究對象，PCR擴增其pcox2and pnad4并進行序列分析，為今后雞蛔蟲的分類、鑒別診斷、分子流行病學調查，以及本病的防治等更深入的研究提供基礎。

1 材料與方法

1．1 蟲體樣品 本試驗研究的12株雞蛔蟲樣品分別采自長沙馬王堆菜市場（MWD1－MWD3）、長沙望城菜市場（WC1－WC3）、長沙瀏陽菜市場（LY1－LY3）、長沙寧鄉菜市場（NX1－NX3）。

1．2 主要試劑 WizardTMDNA Clean－Up System為Promega公司產品；rTaq酶、PCR試劑、DNA Marker DL－2 000為TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司產品；蛋白酶K為天根生化科技（北京）有限公司產品。

1．3 蟲體DNA的提取 從－20℃的冰箱中取出70%酒精保存的蟲體，用純凈水反復吹打沖洗6次后，置于一新的1．5mL Eppendorf管中，用滅菌且經紫外燈照射過的眼科剪刀將蟲體組織剪碎，然后加入200μL的GT buffer反復研磨，再加20μL蛋白酶K，混勻后，放于55℃培養箱中12～16h，其間搖動數次，使蟲體組織裂解充分。將消化好的蟲體懸液按WizardTMDNA Clean－Up System 使用說明書進行蟲體DNA提取，將提取出的DNA于－20℃冰箱保存備用。

1．4 PCR擴增 根據GenBank：HQ704901．1公布的序列，設計特異引物，序列如下：

NAD 4F：CTTATTATTTAATTTTTTATGCTGCT，

NAD 4R：AAGCGGCTAAAGCCTTAGCATCACT；

COX2F：TTTAAGTTTGTTGTATTATTATGGTTT，

COX2F：AAAATACACCAACCACAGGAAAACT；

引物由金思瑞生物科技有限公司進行合成。擴增體系為25μL：雙蒸水15．25μL、10×PCR Buffer（Mg2＋free）2．5μL、MgCl2（25mmol／L each）4 μL、dNTPs（2．5mmol／L）2μL、上 游 引 物 （100 pmol／L）0．5μL、下游引物 （100pmol／L）0．5μL、Taqpolymerase（5U／μL）0．25μL、DNA 模板1 μL；反應在Biometra循環反應儀上進行，擴增條件為：95℃預變性5min，然后94℃變性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s，共37個循環，最后72℃延伸5min。取3μL PCR擴增產物在0．9%TAE瓊脂糖凝膠電泳，用紫外投射儀觀察結果，并用凝膠成像系統攝像記錄。

1．5 pcox2和pnad4序列測定及其在種系發育分析中的應用 將純化后的PCR產物送金思瑞生物科技有限公司直接測序，測序結果用DNAStar 5．0軟件進行分析。從GenBankTM檢索代表性的蛔蟲pcox2序列和pnad4序列與之進行相似性比對和蛔蟲種系發育分析，以雙盲小口線蟲（Contracaecum osculatum）作為外群。利用Clustal X1．81及 Mega 4．0軟件對pcox2和pnad4序列進行比對及計算遺傳距離，然后用Phylip 3．67程序中的最大簡約法（Maximum parasimony，MP）和 Mega 4．0程序中的臨接法（Neighbor－joining method，NJ）繪制種系發育樹，并用Puzzle 5．2程序構建最大似然樹（Maximum Likelihood，ML）。臨接法在軟件默認設置下進行分析；最大簡約法采用Branch and bound模型分析，采用自展檢驗（bootstrap test）估算所構建系統樹的可靠性，ML法采用Hky替代模型和Quartet puzzling搜索程序進行分析，復制數均 為 1 000。 同 時 利 用 DNAStar 5．0 中 的MegAlign程序進行相似性分析。

2 結果及分析

2．1 PCR擴增結果 12個樣品均成功地擴增出約350bp（pcox2）和400bp（pnad4）圖1的片段，與預期目的片段長度相符，且無非特異性條帶，空白對照為陰性。

2．2 測序結果及分析 測序結果顯示，由引物COX2和NAD4擴增的雞蛔蟲pcox2和pnad4片段大小分別為290～310bp和340～360bp，對12條雞蛔蟲pcox2和pnad4序列進行了種內比較，結果顯示，12個不同個體間的pcox2和pnad4序列的差異為0．0%～2．0%和0．0%～3．3%；其樣品差異主要是存在堿基置換和顛換現象。12個分離株pcox2相差6bp、pnad4相差16bp；各長沙分離株之間相應pcox2序列的相似性在98%以上、pnad4序列相似性在96%以上。長沙分離株與基因庫中其他蛔蟲pcox2序列的相似度均低于88% 、pnad4序列的相似度均低于79% 。從堿基組成來分析，12個分離株pcox2的G＋C含量最高為36．14%；A＋T含量最低為63．86%、pnad4的G＋C含量最高為31．48%；A＋T含量最低為68．52% 。

2．3 cox2和nad4序列系統發生樹 通過種系發育分析顯示，利用 Mega 4．1的 NJ法構建了種系發育樹，長沙分離株具有高度同源性（A1－3，B1－3，C1－3，D1－3），長沙分離株位于同一分枝，系統發生樹中的Bootstrap值較高，長沙分離株所屬分枝與其他蛔蟲所屬分支相隔較遠，得到了很好地鑒別見圖2。

3 討論

本試驗結果顯示，各湖南分離株之間相應序列的相似性均在98%（COX2）和96%（NAD4）以上，湖南分離株與基因庫中其他蛔蟲相似度均低于88%（COX2）和79%（NAD4）。17個湖南分離株cox2和nad4序列種間的變異遠遠大于種內的變異，說明cox2和nad4均能為種間的遺傳變異提供遺傳標記，可用于雞蛔蟲的鑒定。采用3種不同方法構建的進化樹具有一致性，均顯示出湖南分離株位于同一分枝，系統發生樹中的Bootstrap值較高，與D．latum的關系最近。湖南分離株所屬分枝與其他蛔蟲所屬分支相隔較遠，得到了很好地鑒別。本項試驗結果表明，雞蛔蟲的cox2和nad4序列種內相對保守，種間差異大，說明cox2和nad4序列能作為雞蛔蟲的遺傳標記用于雞蛔蟲的鑒定。本試驗結果為雞蛔蟲的分類鑒定以及進一步的分子流行病學調查和群體遺傳研究提供了基礎。

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