HPLC法測定浮萍中芹菜素的含量

蘇春英，蘇本華，孫靜

(1.濟南市皮膚病醫院，山東 濟南 250001;2.山東大學附屬省立醫院，山東 濟南 250021;3.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

浮萍為浮萍科植物紫萍［Spirodela polyrrhiza(L.)Schleid.］的干燥全草。味辛，性寒，歸肺、膀胱經，具有發汗解表、利水消腫、清熱解毒之功效。主要含有芹菜素、芹菜素－7－單糖苷、木犀草素、木犀草素－7－單糖苷、牡荊素、葒草素等黃酮類化合物，β－胡蘿卜素、葉黃素、環氧葉黃素等類胡蘿卜素類成分，亞麻酸、棕櫚酸、亞油酸等脂肪酸類成分及以亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸為主要組成的蛋白質類成分。具有強心、收縮血管、升高血壓、抗感染、利尿、促進黑素細胞生長、抗凝血等多方面的藥理作用。臨床主要用于風熱表證、麻疹不透、隱疹瘙癢、水腫、癃閉、瘡癬、丹毒、燙傷等證的治療。2010年版《中國藥典》僅收載性狀、薄層色譜鑒別和水分檢查，無含量測定標準。

近年來，關于浮萍的研究多見于臨床應用等方面，有關浮萍中多糖的含量測定方法及本草考證、紫外鑒別、生藥學研究等已有報道［1－3］，本文首次采用HPLC法測定浮萍中芹菜素的含量，為浮萍藥材的質量控制和合理利用提供實驗依據。

1 儀器與試藥

塞多利斯BP211D型電子天平(德國sartorius);TU－1810型紫外－可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);高效液相色譜儀(Waters Alliance 2695);二極管陣列檢測器(Waters PDA 2996);色譜工作站(Waters Empower)。

芹菜素對照品(批號111901－201001);水為超純水;甲醇為色譜純;其余試劑均為分析純。

浮萍樣品，經山東中醫藥大學石俊英教授鑒定為浮萍科植物紫萍［Spirodela polyrrhiza(L.)Schleid.］的干燥全草。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex－ODS柱(4.6mm ×250mm，5μm);柱溫:40℃;檢測波長:340nm;PDA色譜峰光譜采集范圍:300～400nm;流動相:甲醇 －0.2%磷酸溶液(55:45);流速:1.0ml/min;進樣量:10μl;理論塔板數按芹菜素峰計算應不低于3 000。

2.2 檢測波長的選擇 取芹菜素對照品，用適量甲醇溶解，按分光光度法，在300～400nm之間掃描，在340nm處芹菜素有最大吸收且峰形良好，故確定檢測波長為340nm。

2.3 供試品溶液色譜峰純度檢查 鑒于中藥材難以制備陰性對照，故選用PDA檢測器對供試品溶液色譜峰純度進行檢查。實驗結果顯示，在芹菜素保留時間處，供試品溶液與對照品溶液的光譜圖完全一致，表明在芹菜素保留時間處供試品溶液無其它干擾雜質。

2.4 線性關系考察 取五氧化二磷干燥器中減壓干燥48h以上的芹菜素對照品約25mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容至100ml，作為芹菜素對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備液 1、2、4、8、10ml，用甲醇稀釋并定容至25ml，作為5個濃度的芹菜素對照品溶液，分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以進樣量C為橫坐標，芹菜素吸收峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為:A=20 456+3 323 637C(r=0.999 9)。表明在0.101 68 ～1.016 8μg范圍內，芹菜素進樣量與吸收峰面積之間線性關系良好。

2.5 精密度實驗 取濃度為20.336ug/ml同一芹菜素對照品溶液，連續進樣5次，在上述色譜條件下測定，吸收峰面積分別為:702 833，704 665，707 534，705 509，700 842，平均值 704 277，RSD(%)=0.36%。表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性實驗 取同一供試品溶液，分別于制備0、1、2、4、8、10h后 測 定，吸 收 峰面 積 分別 為:1 285 737，1 285 033，1 278 138，1 271 055，1 275 826，1 254 859，平均值 1 275 108，RSD(%)=0.89%。表明在制備后10h內供試品溶液基本穩定。

2.7 重復性實驗 取同一樣品，平行制備5份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算芹菜素的含量分別為0.944mg/g， 0.936mg/g， 0.932mg/g， 0.942mg/g，0.946mg/g，平均值 0.94mg/g，RSD(%)=0.62%。表明方法的重現性良好。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知芹菜素含量的樣品6份，分別精密加入一定量的對照品，按樣品測定方法處理并測定，計算加樣回收率，結果見表1。芹菜素的平均加樣回收率98.91%，RSD(%)=1.07%。表明測定方法準確、可靠。

表1 芹菜素含量測定加樣回收率實驗結果(n=6)

2.9 樣品測定 取過三號篩的樣品粉末1g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)100ml，回流提取至提取液無色，棄去溶劑，藥渣揮干石油醚，加甲醇100ml回流提取2h，濾過，提取液水浴蒸干，殘渣精密加入甲醇－25%HCL溶液(4:1)混合液25ml，稱重，加熱回流30min，放冷，用甲醇補足損失的重量，濾過，取續濾液作為供試品溶液。按上述色譜條件，分別精密吸取對照品和供試品溶液各10μl，測定，計算。結果見圖1，表2。

圖1 芹菜素含量測定高效液相色譜圖

表2 浮萍中芹菜素含量測定結果(n=3)

3 討論與小結

3.1 由于浮萍中成分復雜，含有脂肪酸、葉綠素等脂溶性組分干擾芹菜素的測定，因此對樣品先進行了脫脂處理。根據文獻報道［4］，芹菜素在浮萍中主要以苷的形式存在，因此將樣品水解以后進行測定。供試品溶液制備過程中對提取時間進行了比較，提取2h以后，延長提取時間，測得芹菜素含量不再增加，故確定提取時間為 2h。水解時間比較了 10min、20min、30min、40min，結果表明，水解30min測得芹菜素含量最高，故確定水解時間為30min。

3.2 HPLC法測定浮萍中芹菜素的含量，操作簡便、準確、靈敏度高，通過穩定性、重復性、加樣回收率等方法學考察表明，符合含量測定的要求。建議《中國藥典》中增加浮萍的含量測定項，以更好的控制藥材的質量。

［1］周菁，王伯初，王陽.浮萍多糖總糖含量測定與評價［J］.重慶大學學報(自然科學版)，2005，28(10):71 －72.

［2］陳桂榮，羅集鵬.浮萍的本草考證與紫外光譜法鑒別［J］.中藥材，2005，28(6):18 －19.

［3］胡本祥，鄭俊華，楊樹榮.浮萍的生藥形態及組織學研究［J］.陜西中醫學院學報，2002，25(3):31 －32.

［4］凌云，何板作，鮑燕燕，等.浮萍的化學成分研究［J］.中草藥，1999，30(2):24－26.