石榴皮總黃酮的微波提取工藝及含量測定研究

霍文 張衛國 王雅寧

（河北聯合大學，河北 唐山 063000）

石榴皮是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮，為《中國藥典》歷版收載的品種，具有澀腸、止血、驅蟲等功效[1]，含有黃酮類、鞣質類、有機酸類等多種化合物。近年來發現黃酮類化合物的生理活性較為廣泛，在抗誘變、抗腫瘤、抗微生物、抗衰老等方面具有良好的作用，并具有清除自由基和抗氧化的能力。此外，黃酮類化合物還能調節心肌收縮、降血壓、防止血管破裂、止血、抗炎、調節免疫、抗微生物、抗腫瘤和改善心肌舒張功能，可以提高機體在常壓與低壓下的耐缺氧能力，對抗各種因素造成的心律失常[2]。本實驗采用單因素試驗和正交試驗對微波法提取石榴皮中總黃酮的工藝進行研究，并測定總黃酮含量，旨在為石榴皮的進一步開發利用以及質量標準的改進提供參考依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TV-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），微波催化合成/萃取儀（祥鵠科技），KDC-1042低速離心機（科大創新股份公司中佳分公司）。

1.2 試藥

石榴皮藥材購自唐山市醫藥公司藥材站，產地四川，經河北聯合大學藥學院生藥教研室鑒定為石榴科石榴的的干燥果皮。蘆丁對照品購自原中國藥品生物制品檢定所，批號100080-200707。乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為國產分析純。

2 實驗方法和結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品（作為黃酮標準對照品）0.010 7 g，置于50 mL量瓶中，加適量60%乙醇，于水浴上微熱溶解，放冷，稀釋至刻度，搖勻，配置成0.214 mg/mL的對照品溶液。

2.2 檢測波長的確定

吸取蘆丁對照品溶液7.5 mL置于50 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁 1 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉10 mL，搖勻，并用60%乙醇定容，搖勻，放置15 min顯色[3]。于紫外可見分光光度計上在200～700 nm波長范圍內進行掃描。結果表明，蘆丁在501 nm下有最大吸收，故選其作為測定波長。

2.3 總黃酮標準曲線的繪制

精密量取蘆丁對照品溶液 0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mL置于50 mL量瓶中，按照2.2項下方法顯色，在501 nm處測定溶液的吸光度（A）值，以A值對質量濃度（C）進行線性回歸分析，表明蘆丁在0.010 7～0.053 5 mg/mL質量濃度范圍內有良好的線性關系。回歸方程為

A=14.075 C－0.037 2

r=0.999 8（n=5）。

2.4 單因素試驗

2.4.1 乙醇溶液體積分數的選擇 精密稱定4份石榴皮粉末各 2.0 g，在料液比 1∶20，微波功率500 w，乙醇體積分數分別為 20%，40%，60%，80%條件下，作用1 min，間歇提取3次。 在轉速2 000 r/min條件下進行低速離心5 min，取上清液置于100 mL量瓶中，并用60%乙醇定容，搖勻。

精密量取上述量瓶中溶液各2 mL，置于50 mL量瓶中，按照2.2項下方法顯色，在501 nm處測定A值，結果見圖1。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮提取的影響

隨著乙醇體積分數的增加，A值增加。但當乙醇體積分數超過60%后，A值有所下降。說明體積分數60%的乙醇溶液相對其他濃度能更好地提取出石榴皮中的黃酮類化合物。

2.4.2 微波時間的選擇 精密稱定4份石榴皮粉末各 2.0 g，在料液比 1∶20，微波功率 500 w，乙醇體積分數為 60%條件下，分別作用 60，90，120，150 s，間歇提取3次，按照2.4.1項下步驟配制供試品溶液并顯色測定，結果見圖2。

圖2 微波時間對總黃酮提取的影響

隨著微波時間的增加，A值增加。在120 s時達到最大值，之后隨時間增加A值反而下降。說明微波作用120 s提取石榴皮中的總黃酮較為適宜。

2.4.3 料液比的選擇 精密稱定4份石榴皮粉末各2.0 g，在微波功率500 w，乙醇濃度為60%，料液比分別為 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 條件下，作用1 min，間歇提取3次。按照2.4.1項下步驟配制供試品溶液并顯色，結果見圖3。

圖3 料液比對總黃酮提取的影響

可見，料液比為1∶20時 A值最大，隨料液比增高，A值反而下降，說明提取率有所降低。

2.4.4 微波功率的選擇 精密稱定4份石榴皮粉末各2.0 g，在乙醇濃度為60%，料液比為1:20，微波功率分別為 300，400，500，600 w 條件下，作用1 min，間歇提取3次。按照2.4.1項下步驟配制溶液并顯色，結果見圖4。

可見，隨著微波功率的增加，A值無明顯變化（P＞0.05），說明微波功率對石榴皮中總黃酮的提取無明顯影響。

圖4 微波功率對總黃酮提取的影響

2.5 正交試驗

通過單因素試驗對上述不同提取工藝參數進行了初步的篩選；為確定最佳提取工藝，同時進行了正交試驗。參照單因素試驗結果，可知微波功率對石榴皮中總黃酮的提取無顯著影響，故進行正交試驗時可考慮忽略此因素的影響。因此設計乙醇溶液體積分數（A）、微波作用時間（B）及料液比（C）3個影響因素，在各自的不同水平進行正交試驗[4]，實驗設計及方差分析結果見表 1，2，3。

方差分析結果顯示，因素A具有顯著性差異（F 比＞F0.05，2.2=19.0），而因素 B，C 不具有顯著性（F 比＜F0.05，2.2=19.0），即乙醇體積分數對總黃酮提取具有顯著的影響。

由表2，3結果可知，A和C對石榴皮中總黃酮的提取有較大影響，B影響較小。故最佳提取工藝為A2B3C3。即乙醇體積分數為 60%、料液比1∶25、微波時間為120 s。

表1 正交試驗因素水平

2.6 樣品含量測定

精密稱定5份石榴皮粉末各2.0 g，在料液比1∶25，微波功率 500 w，乙醇濃度為 60%條件下，分別作用 120 s，間歇提取3次。2 000 r/min條件下進行低速離心，離心5 min，取上清液置于100 mL量瓶中，并用60%乙醇定容，搖勻，得供試品溶液。

表2 L9（34）正交試驗設計方案及結果

表3 正交試驗結果方差分析

精密量取上述量瓶中溶液各1 mL，置于50 mL量瓶中，按照2.2項下方法顯色，在501 nm處測定A值，見表4。

表4 樣品含量測定結果（n=5）

2.7 精密度試驗

精密稱定石榴皮粉末2.0 g，按2.6項下方法制備供試品溶液，精密量取上述溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，按照2.2項下方法顯色，于501 nm處連續測定A值6次，RSD為0.205%，說明供試品溶液精密度良好。

2.8 穩定性試驗

精密量取含量測定項下制備的同一份供試品溶液每隔10 min測定1次A值，結果在 40 min內A值無顯著變化，RSD為2.34%，說明供試品溶液在40 min內穩定性較好。

2.9 加樣回收率的測定

取已知含量的石榴皮粉末5份，每份約2.0 g，精密稱定。按2.6項下方法制備供試品溶液。精密量取上述供試品溶液各1 mL，置于50 mL容量瓶中，分別加入5 mL蘆丁對照品溶液，按照2.2項下方法顯色，于501 nm處分別測定A值，計算回收率，見表 5。

表5 加樣回收率試驗結果（n=5）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取一定濃度的蘆丁對照品溶液，采用硝酸鋁顯色法，在200～700 nm波長范圍內進行光譜掃描，結果在370 nm附近和501 nm處分別有最大吸收，但在501 nm處光譜峰峰形更理想，而在370 nm附近光譜峰較為雜亂，故選定501 nm為檢測波長。

3.2 黃酮類成分提取方法的選擇

黃酮類成分常用加水煎煮法、堿提酸沉法或乙醇、甲醇浸泡提取法,費時、費工、提取率低。微波提取法利用微波能迅速破壞細胞壁加快活性成分溶出，使許多難溶性物質在微波電磁場的作用下得到較好溶解，從而提高了提取速度和得率[5]，因此與常規提取方法相比具有選擇性強，耗時短，能耗低，排污量少[6]，溶劑用量少，提取效率高，有效成分破壞少等優點，故本研究采用微波提取法。

3.3 總黃酮含量測定方法的選擇

分光光度法一般用于總黃酮含量測定，由于其他組分干擾，影響測定的準確性，多需進行顯色測定。利用黃酮類與金屬鹽類試劑顯色，再進行光譜測定，能顯著提高含量測定的選擇性及靈敏度[7]。故本實驗選擇硝酸鋁顯色法，方法準確可靠。劉苑等[8]采用直接紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，于360.5 nm處測定了毛茛藥材不同萃取部位的總黃酮含量，平均回收率均在95%～105%范圍內。薄層掃描法和高效液相色譜法是測定單體黃酮有效方法[7]。如黃芩苷、槲皮素和葛根素等均為黃酮類主要代表成分，有報道[9]采用反相高效液相色譜法測定五味安神顆粒中葛根素的含量，方法靈敏度高，重復性好，簡便準確，平均回收率為100.1%。羅愛勤等[10]采用HPLC測定腎石通顆粒中槲皮素含量，方法靈敏、準確，平均回收率為98.8%，可作為腎石通顆粒的質控方法。因此對含有黃酮類成分的中藥材和制劑，可按要求選擇不同方法測定總黃酮或單體黃酮進行質量控制。

本研究確定了微波提取法提取石榴皮藥材中總黃酮的最佳提取工藝，測定了總黃酮含量，為石榴皮開發利用和藥材的質量標準制定提供了參考依據，且該方法具有良好的應用前景。

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