紅外及近紅外光譜法對真偽龍齒的快速鑒別△

黃必勝，袁明洋，余馳，陳科力*

(1.湖北中醫藥大學&教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室，湖北 武漢 430065； 2.仙桃市藥品檢驗所，湖北 仙桃 433000)

紅外及近紅外光譜法對真偽龍齒的快速鑒別△

黃必勝1，袁明洋1，余馳2，陳科力1*

(1.湖北中醫藥大學&教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室，湖北 武漢 430065； 2.仙桃市藥品檢驗所，湖北 仙桃 433000)

目的：建立近紅外光譜對真偽龍齒的快速識別方法。方法：采用近紅外光譜法對真偽龍齒進行化學成分分析，在此基礎上探索建立近紅外光譜聚類分析模型，并驗證模型的準確性。結果：在紅外光譜區真偽龍齒都有其特征吸收峰，且偽品龍齒具有更多的峰信息；在此基礎上成功建立了近紅外光譜聚類分析模型。結論：紅外光譜法可以作為驗證龍齒化學成分的一種方法，而利用近紅外光譜法建立相應的模型可以快速準確地鑒別真偽龍齒。

龍齒；紅外光譜；近紅光譜法；聚類分析

中藥龍齒為古代哺乳動物牙齒的化石，隨著其資源的日益減少和價格的提高，其混偽品也日漸增多。如：將牛或其他哺乳動物的牙齒經石灰窖埋后，再打碎成細小碎塊或粉末后充“白龍齒”出售[1]。其外觀性狀與正品大致相同，外觀類似，不易區別，而以性狀鑒別為基礎的經驗鑒別因主觀性較強很難快速準確鑒別其真偽，因此探索采用中紅外光譜對真偽龍齒進行鑒別。近年來，利用近紅外光譜法鑒別中藥材真偽的研究越來越多[2-6]，而對中藥龍齒真偽鑒別尚無。筆者嘗試利用近紅光譜法對真偽龍齒進行快速分析研究，并建立相應的定性模型，所建立的聚類分析模型可以快速鑒別真偽龍齒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spectrum 400傅立葉變換紅外光譜儀，測定范圍：4 000～400 cm-1，車載近紅外光譜儀(MATRIX-F型，外接1.5 m固體光纖探頭)，OPUS工作站。

1.2 材料

23批樣品分別采自于湖北中醫藥大學標本館、安徽亳州中藥材市場、河北安國中藥材市場、河南禹州中藥材市場、湖南廉橋中藥材市場以及湖南花板橋中藥材市場。每批樣品均經過湖北中醫藥大學生藥學教研室陳科力教授鑒定。

溴化鉀(KBr)(AR，國藥集團化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 中紅外光譜分析

取龍齒原藥材洗凈，晾干，砸成小塊，粉碎過200目篩備用。分別將樣品粉末和磨細的溴化鉀按1∶100的比例在瑪瑙研缽中混合均勻，在手動壓片機上制成透明薄片進行測試。測定區域4 000～400 cm-1，掃描次數16次，分辨率4 cm-1，數據處理圖譜經計算機自動基線校正和自動縱坐標標準化處理。對比真偽龍齒的紅外吸收圖譜，如圖1，發現二者有相似之處。由于龍齒的主要成分為碳酸鈣和磷酸鈣[7]，從其紅外吸收光譜可以觀察到磷酸鈣的特征吸收峰1 033，957，602，565，470 cm-1，其中1 033 cm-1為PO42-反對稱伸縮振動，957 cm-1為PO42-對稱伸縮振動，602、565 cm-1為PO42-不對稱變角振動，470 cm-1為PO42-對稱變角振動。CO32-的4個原子處于同一平面內，3個氧原子在正三角形的3個頂點。CO32-有4種振動模式，分別是反對稱伸縮振動、對稱伸縮振動、面外彎曲振動、面內彎曲振動。CO32-所對應的紅外吸收峰位置分別處于以下4個窄帶之內：1 510～1 390 cm-1，1 120～1 045 cm-1，885～820 cm-1，775～680 cm-1。圖1中對應的CO32-吸收峰為1 452，1 423，1 033，863，711 cm-1，其中CO32-反對稱伸縮振動對應1 452，1 423 cm-1雙峰，1 033 cm-1本該為弱峰，該處有PO42-反對稱伸縮振動的貢獻，故為強峰。3 443 cm-1處為O-H伸縮振動吸收峰，因龍齒中還含有甘氨酸、胱氨酸、蛋氨酸等7種氨基酸[8]；1 636 cm-1可能為酰胺基中的羰基吸收峰。

從峰位上看，圖1所示的真偽龍齒紅外光譜在峰數和形狀上幾乎一致，但在820～660 cm-1區域二者的圖譜存在著微小差異，偽品龍齒含有更多的峰信號。結果表明：在紅外光譜吸收范圍內，偽品龍齒較正品龍齒含有更多的物質信息。

圖1 真偽龍齒紅外光譜圖

2.2 近紅外光譜分析

2.2.1 近紅外光譜的采集 所采集的樣品多來源于國內流通量較大的中藥材專業市場內主營礦物類藥材店面，樣品具有一定的地域代表性。對龍齒藥材樣品進行光譜采集前應該仔細觀察采集面的物理特征，排除樣品表面可能混有其他無機雜質部位，以免影響樣品蘊含的真實光譜信息；其次，龍齒藥材外部棱角分明，在進行近紅外掃描時，應選擇平整部分，使光纖探頭與樣品貼合緊密，減少光的散射；另外，樣品內的化學成分分布可能不一致，采集光譜時應分次對藥材的各個面進行掃描，保證樣品數據的完整性。同時將藥材粉碎，混合均勻后，對其粉末進行光譜采集。

光譜采集參數：掃描波數間隔為8 cm-1，掃描累積32次，掃描區間為12 000～4 000 cm-1，InGaAs檢測器，光纖傳導。每份藥材樣品各面掃描共10次，藥材粉末重復掃描10次。龍齒原藥材及藥材粉末近紅外圖譜見圖2。

圖2 龍齒原藥材及粉末近紅外光譜圖

由圖2可以看出，龍齒藥材粉末的10張近紅外光譜重合在一起，光譜之間的差異性很小；而龍齒原藥材不同部位掃描得到的10張近紅外光譜各有差異，各個光譜不僅在吸光度上有差別，在峰形上也千差萬別。因此將原藥材不同面采集的圖譜與原藥材粉末的圖譜結合起來共同建立定性模型，既增大了藥材的信息量，又加強了模型的適用性。

2.2.2 真偽龍齒近紅外光譜聚類分析定性模型的建立 從23批次樣品中隨機挑選11批樣品，編號為LQ-004號樣品藥材采集光譜后，將其粉碎制成編號為LQ-004-1號樣品，故訓練集樣品共12批次，其余12批次為驗證集樣品。訓練集樣品信息見表1，驗證集樣品信息見表2。

表1 真偽龍齒訓練集樣品信息

表2 真偽龍齒驗證集樣品信息

對上述樣品的光譜圖進行仔細觀察，發現所有樣品的近紅外光譜整體上較為相似，經過一階導數處理后，光譜差異變得明顯，樣品的近紅外漫反射原始光譜和一階導數光譜見圖3。

圖3 真偽龍齒的近紅外原始光譜及一階導數光譜

從樣品原始圖譜可以觀察到龍齒及其偽品在9 000～8 000 cm-1，7 000～5 600 cm-1，4 800～4 000 cm-13個波長區域內光譜信號稍有不同，光譜經過一階導數處理后，上述區域光譜差異更加明顯。由于建模樣品涉及到原藥材(塊狀)與藥材粉末，樣品的徑粒對近紅外光譜具有明顯的影響[9]，而矢量歸一化法可以消除徑粒對光譜的影響，因此采用矢量歸一化方法對圖譜進行預處理是必要的。OPUS軟件可以對圖譜進行預處理，通過考察一階導數、一階導數+矢量歸一化、二階導數、二階導數+矢量歸一化4種預處理方法進行聚類分析，發現利用一階導數和一階導數+矢量歸一化預處理圖譜進行聚類分析可以準確將真偽龍齒區別開。為了增加模型的適用性，消除樣品徑粒對光譜的影響，我們選擇預處理方法為：一階導數+矢量歸一化。預處理方法中還包含有平滑點數的選擇，平滑可以消除誤差、改進數據，在本模型中選擇5、9、13點平滑均未對聚類分析結果產生影響，但是平滑點數過多，會使數據失真，所以選擇9點平滑。波段范圍：9 000～8 000 cm-1，7 000～5 600 cm-1，4 800～4 000 cm-1，采用Ward’s algorithm(標準算法)計算，真偽龍齒聚類分析圖見圖4。

由圖4可以看出，龍齒真品和偽品各聚為一類。在樹狀圖的左支(A)中，LQ-004-1、AG-017、YZ-022、AG-023、HBQ-002和BZD-002號樣品各自的10張光譜最先聚為一類，而其他6批樣品各自的10張光譜聚類較分散，說明龍齒藥材不同部位的化學成分可能有一定差異，藥材表面物理性質的差異也會對光譜產生影響；而藥材粉碎成粉末后，其化學成分分布較均勻，故光譜的距離較小。另外LQ-004號樣品的10張光譜與其他正品樣品聚類，而與LQ-004-1號樣品聚類的僅有1張光譜，提示藥材經過粉碎后其光譜會較原藥材發生變化，可能是徑粒等物理因素的影響或者是原藥材中的化學成分重新分布。在樹狀圖的右支(B)，LQ-006、BZC-043和ZY-035的圖譜在各小分支中聚集比較緊密，說明實驗的3批龍齒藥材偽品的化學成分較為接近，可能為同一種摻偽方式。從上述聚類分析圖譜可以明顯觀察到真偽龍齒之間的區別，因此利用近紅外聚類分析法可以快速準確地鑒別真偽龍齒。

2.2.3 模型的驗證 將驗證集的11批樣品110張光譜帶入到已建好的真偽龍齒定性模型中，對所有圖譜的正確識別率為72%，假陽性率為19%，如果以每一批樣品中的10張圖譜中的6張或以上被正確識別，則認為對這一批樣品鑒別正確，那模型的識別率為82%。通過對上述模型的驗證，我們建立的龍齒近紅外定性鑒別模型基本能快速準確地鑒別真偽龍齒。

3 討論

龍齒為古代哺乳動物牙齒的化石，它們早期最原始的形態是動物的牙齒，牙齒因為有機質較少，無機質較多，故能保存較長的時間。牙齒被泥沙掩埋后地下水將過剩的礦物質沉淀下來或成為晶體，隨著水流會逐漸滲進泥沙中，填補牙齒有機質腐爛后留下的空間，天長日久，原來的牙齒變成了還保存牙齒原有外形和內部結構的石頭。而從國內大型專業中藥材市場采集的龍齒偽品，經陳科力教授鑒定為大型動物的牙齒，經酸腐蝕和土埋處理后，作為龍齒銷售。因此用中紅外光譜法分析真偽龍齒時，龍齒偽品含有較多的峰信息，可能為大型動物牙齒中少量的有機物特征信息。

在聚類分析模型中，發現各批龍齒原藥材的10張近紅外光譜在小類上相互聚集，藥材粉末的10張光譜都能緊緊地聚在一起。同一批龍齒的原藥材光譜只有部分光譜與其粉末的10張光譜聚為一類，可能的原因在于龍齒原藥材表面的化學成分分布不均勻。如：龍齒表面的琺瑯質和龍齒橫斷面，在同一藥材不同面采集的10張近紅外光譜分別包含著相同或不同的化學信息，因此影響了模型的正確率。另外，各批次間的龍齒正品或龍齒偽品的化學信息也會有所不同，這也可能影響近紅外聚類分析模型的正確率。

近紅外光譜技術具有快速、無損分析的特點，實驗利用近紅外光譜聚類分析法對真偽龍齒定性鑒別，結果表明從龍齒藥材各部位采集的光譜信息有所差異，藥材粉末光譜信息重復性較好，利用近紅外光譜聚類分析法可以快速準確鑒別龍齒真偽品。

實驗中用于建立近紅外定性模型的樣品數量有限，不能涵蓋所有真偽龍齒的信息，這對模型的適用性有一定的影響，采集到一定數量的樣品后，可以利用近紅外光譜技術建立相應的定性模型，達到快速準確鑒別的目的。

[1] 陳照榮，來平凡.發現一種新的龍齒偽品[J].浙江中醫學院學報，2000，24(5)：77.

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[3] 張治軍，饒偉文.三七及其偽品的近紅外光譜鑒別法[J].中國藥房，2009，20(30)：2367-2369.

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[6] 劉荔荔，邢旺興，賈暖，等.近紅外漫反射光譜聚類分析用于中藥紅曲的鑒別[J].第二軍醫大學學報，2002，23(11)：1230-1232.

[7] 康廷國.中藥鑒定學[M].北京：中國中醫藥出版社，2008：560.

[8] 張保國.礦物藥[M].北京：中國醫藥科技出版社，2005：22.

[9] 胡昌勤，馮艷春.近紅外光譜法快速分析藥品[M].北京：化學工業出版社，2010：135.

IRSpectroscopicandNear-infraredSpectroscopicMethodforRapidIdentificationofDensDraconisanditsCounterfeit

HUANG Bi-sheng1，YUAN Ming-yang1，YU Chi2，CHEN Ke-li1*

(1.KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResourceandCompoundPrescription，HubeiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430065,China；2.TheXiantaoInstituteforDrugControl，Xiantao433000,China)

Objective：To establish a rapid near-infrared spectroscopy identification method for Dens Draconis and its adulterants.Methods：Analyzed the Chemical composition of Dens Draconis and its adulterant by IR，established near-infrared spectral clustering analysis model.The accuracy of the model was verified.Results：Dens Draconis and its adulterant had different characteristic absorption peaks in the infrared spectral region，and the adulterants had more peaks information.On this basis，the near-infrared spectral clustering model was established successfully.Conclusion：IR is suitable to verify chemical composition of Dens Draconis.Dens Draconis and its adulterants could be quickly and accurately identified by the near-infrared spectral clustering analysis model.

Dens Draconis；IR spectroscopy；Near-infrared spectroscopy；Clustering analysis

2013-04-18)

武漢市2012年高新技術產業發展行動計劃——生物技術與新醫藥專項(201260523193)

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陳科力，教授，研究方向：中藥資源及其品質研究;E-mail：kelichen@126.com