補(bǔ)腎解毒方聯(lián)合程序性死亡受體配體-1抗體對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的研究*

蔡本強(qiáng) 賀勁松 邢宇鋒 馬曉軍

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳附屬醫(yī)院肝病科 (廣東深圳，518033) 2.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院感染科

慢性HBV感染時(shí)，樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞免疫功能低下，誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的HBV特異性CTL免疫應(yīng)答，是乙肝疫苗研制的關(guān)鍵內(nèi)容。在前期對(duì)補(bǔ)腎解毒方能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫功能及具有抑制HBV DNA作用研究基礎(chǔ)上，本研究使用PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1通路，并以補(bǔ)腎解毒方輔助免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察其對(duì)小鼠CTL細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響，為尋找能有效抗HBV免疫方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，SPF級(jí)，雌雄不限，8～10周齡，20～30g，購(gòu)自廣州空軍醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。HepG 2.2.15細(xì)胞為本室自行傳代培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 補(bǔ)腎解毒方:由仙靈脾30g，菟絲子10g，杜仲、懷牛膝、枸杞子、枳殼、郁金、印度葉下珠各15g組成;文火煎煮，制成中藥湯劑，使用時(shí)用藥濃度為生藥含量2.51g/ml。PD-L1單克隆抗體、對(duì)照抗體IgG2a購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。PBS本室自行配制。HBsAg蛋白由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，重組小鼠IL-2為Peprotech公司產(chǎn)品。異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的抗小鼠CD8單克隆抗體、別藻藍(lán)蛋白 (APC)標(biāo)記抗PD-1流式抗體購(gòu)自美國(guó)ebioscience公司。流式洗滌液為含5g/L BSA，1g/L NaN3的PBS。IFN-γ ELISA試劑盒購(gòu)自晶美公司。非放射性乳酸脫氫酶 (LDH)釋放法檢測(cè)試劑盒Cyto Tox 96購(gòu)自美國(guó)promega公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECTON DICKINSON產(chǎn)品。瑞士Tecan SUNRISE酶標(biāo)儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，每組10只。給予相應(yīng)處理方法，共分4組，即聯(lián)合組:給予補(bǔ)腎健脾解毒方聯(lián)合PD-L1抗體;對(duì)照組設(shè)補(bǔ)腎解毒方組、PDL-1抗體組和PBS組，分別給予補(bǔ)腎解毒方+對(duì)照抗體IgG2a、PDL-1抗體+PBS、對(duì)照抗體IgG2a+PBS。

1.4.2 給藥方式 補(bǔ)腎解毒方:使用時(shí)用藥濃度為生藥含量2.51g/ml，每次灌胃2ml/只，2次/d。PBS:每次灌胃2ml/只，2次/d。PD-L1抗體或?qū)φ湛贵w IgG2a:腹腔注射，200μg/只，每3日1次，共4次。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)方案 各組小鼠給予相應(yīng)藥物治療兩周。在治療結(jié)束后脫臼處死小鼠，取脾臟，按常規(guī)方法制備濃度為5×106/ml的細(xì)胞懸液分別進(jìn)行以下相應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4.4 脾臟細(xì)胞上清液細(xì)胞因子檢測(cè) 將各組小鼠脾臟細(xì)胞分別加入24孔培養(yǎng)板 (1ml/孔)，加 HBsAg(10μg/ml)刺激，37℃、5%CO2培養(yǎng)48小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液置于－20℃待檢。嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)IFN-γ分泌水平。

1.4.5 T細(xì)胞表面PD-1分子表達(dá)檢測(cè) 上述脾臟細(xì)胞，在24孔培養(yǎng)板中用含rhIL-2(100U/ml)的RMPI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，第4天時(shí)，收集細(xì)胞，PBS重懸，調(diào)整濃度為5×106/ml。取1×106個(gè)細(xì)胞，分別加入APC標(biāo)記的抗小鼠PD-1抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體各20μl，室溫避光孵育20分鐘;PBS液洗滌1次，加入PBS 200μl重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每份標(biāo)本設(shè)空白對(duì)照。

1.4.6 LDH釋放法檢測(cè)HBsAg特異性CTL活性 ①小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，用含2mg/L的 ConA、100U/ml rhIL-2、HBsAg蛋白的RMPI-1460完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3天，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L，此即特異性實(shí)驗(yàn)中的效應(yīng)細(xì)胞 (HBsAg特異性CTL)。②HepG 2.2.15細(xì)胞傳代培養(yǎng)，收集后，PBS重懸，調(diào)整濃度為1×107/ml。以HepG 2.2.15細(xì)胞作為靶細(xì)胞，效靶比分別為25∶1，50∶1，100∶1，共培養(yǎng)4小時(shí)后，按Cyto Tox 96試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行殺傷活性檢測(cè)。CTL殺傷活性=(效靶混合細(xì)胞釋放OD值－靶細(xì)胞自然釋放OD值)/(靶細(xì)胞最大釋放OD值－靶細(xì)胞自然釋放OD值)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以方差分析，t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 脾細(xì)胞上清液分泌IFN-γ水平及CD8+T細(xì)胞表面PD-1分子表達(dá)水平 見(jiàn)表1。脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ分泌水平，聯(lián)合組明顯高于PD-L1抗體組、補(bǔ)腎解毒方組、PBS組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性意義 (P＜0.01或0.05);補(bǔ)腎解毒方組、PDL1抗體組分別與PBS組比較，差異有顯著性意義 (P＜0.01或0.05);補(bǔ)腎解毒方組與PD-L1抗體組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CD8+淋巴細(xì)胞表面PD-1分子表達(dá)水平，聯(lián)合組明顯低于PD-L1抗體組、補(bǔ)腎解毒方組、PBS組，差異有顯著性意義 (P＜0.01);補(bǔ)腎解毒方組、PD-L1抗體組分別與PBS比較，差異有顯著性意義 (P＜0.01);補(bǔ)腎解毒方組與PD-L1抗體組比較，差異有顯著性意義 (P＜0.01)。

表1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌水平及CD8+T細(xì)胞表面PD-1分子表達(dá)水平(±s)

表1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌水平及CD8+T細(xì)胞表面PD-1分子表達(dá)水平(±s)

與PBS組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與聯(lián)合組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與PDL-1組比較，##P＜0.01

組別 n IFN-γ(ng/ml) CD8+PD-1+細(xì)胞 (%)PBS組 10 121.22±21.33＊＊ 22.5±4.76＊＊補(bǔ)腎解毒方組 10 148.53±22.65△＊＊ 19.3±3.24△△＊＊##PDL-1組 10 159.32±27.35△△＊ 12.2±3.67△△＊＊聯(lián)合組 10 187.72±29.67△△ 6.7±2.06△△

2.2 小鼠脾臟HBsAg特異性T淋巴細(xì)胞殺傷活性 見(jiàn)表2。如表2所示，各組小鼠脾臟HBsAg特異性T淋巴細(xì)胞殺傷活性比較:效靶細(xì)胞比例為100∶1或50∶1時(shí)，聯(lián)合組明顯高于PDL-1抗體組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性意義 (P＜0.05);聯(lián)合組、PDL-1抗體組高于補(bǔ)腎解毒方組及PBS，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性意義 (P＜0.01或0.05);補(bǔ)腎解毒方組與PBS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。

效靶細(xì)胞比例為25∶1時(shí)，脾臟HBsAg特異性T淋巴細(xì)胞殺傷活性，聯(lián)合組高于PBS組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性意義，(P＜0.05);補(bǔ)腎解毒方組、PDL-1抗體組分別與PBS組、聯(lián)合組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。

表2 各組小鼠脾臟HBsAg特異性T淋巴細(xì)胞殺傷活性

3 討論

宿主對(duì)HBV抗原產(chǎn)生不同程度的特異性免疫無(wú)應(yīng)答即免疫耐受，T細(xì)胞處于無(wú)能或耗竭狀態(tài)，被認(rèn)為是HBV感染慢性化的主要機(jī)制［1］。而HBV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是CTL是清除HBV感染的重要方式。因此，有效地清除HBV離不開(kāi)機(jī)體T細(xì)胞免疫的重建。

在急性和慢性HBV感染的研究中發(fā)現(xiàn)，耗竭或免疫無(wú)能的T細(xì)胞表面高表達(dá)PD-1，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)HBV的免疫耐受［2］。阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，被證實(shí)可以恢復(fù)病毒感染時(shí)無(wú)能T細(xì)胞的功能，增強(qiáng)疫苗的特異免疫水平［3，4］。封閉PD-l/PDL1通路，如使用PD-L1抗體方法，有可能逆轉(zhuǎn)病毒持續(xù)感染和慢性感染。目前該方法應(yīng)用在抗HBV感染方面較少，有待在HBV轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及臨床中進(jìn)一步研究。

近年來(lái)我們依據(jù)乙型肝炎“正虛濕熱毒邪入侵”的發(fā)病機(jī)理，采用補(bǔ)腎清透法和補(bǔ)腎健脾法治療慢性乙型肝炎及攜帶者，在抑制HBV DNA復(fù)制及e抗原的陰轉(zhuǎn)皆有較好的療效，且對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠MHC(主要組織相容性復(fù)合體)Ⅰ和MHCⅡ分子表達(dá)及T細(xì)胞的免疫功能方面有一定的調(diào)節(jié)作用［5～7］。本研究補(bǔ)腎解毒方中菟絲子、仙靈脾、杜仲、懷牛膝為補(bǔ)腎方陣，共為君藥，針對(duì)乙型肝炎的正虛本質(zhì)，固補(bǔ)腎精，可鼓邪外出;葉下珠性苦寒，具清熱解毒利濕之效，為臣藥;枳殼、郁金行氣活血，共為佐藥;枸杞子為使藥，引諸藥入肝血。全方組成針對(duì)慢性乙型肝炎的核心病機(jī)，君臣佐使配伍合理，先后天并補(bǔ)，虛實(shí)兼治，清、補(bǔ)、活一體，共奏補(bǔ)腎解毒、活血利濕之功。為進(jìn)一步明確HBV慢性感染時(shí)補(bǔ)腎解毒方對(duì)T細(xì)胞免疫的調(diào)理作用，我們使用該制劑聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路的方法，觀察其對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠特異性T細(xì)胞應(yīng)答水平、T細(xì)胞表面PD-1水平的影響，同時(shí)探討促進(jìn)T細(xì)胞功能恢復(fù)的有效方法。

本研究結(jié)果表明，PD-L1抗體可以阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，降低T細(xì)胞表面PD-1分子的表達(dá);提高小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌水平;并且能夠顯著提高HBsAg特異性CTL殺傷活性。使用補(bǔ)腎解毒方后，PD-L1抗體引起的上述免疫變化進(jìn)一步增強(qiáng)。提示，補(bǔ)腎解毒方增強(qiáng)應(yīng)用PD-L1抗體對(duì)T細(xì)胞功能的恢復(fù)作用，能增強(qiáng)特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。

Boni等利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型，證實(shí)病毒特異性T細(xì)胞分泌IFN-γ水平與表面PD-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［8］。而本研究結(jié)果提示，補(bǔ)腎解毒方能顯著促進(jìn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ水平。因此，補(bǔ)腎解毒方能調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IFN-γ，可能為其能減少PD-1表達(dá)，提高T細(xì)胞免疫功能的原因之一。

總之，本研究表明，阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路可以恢復(fù)慢性HBV感染時(shí)特異性T細(xì)胞功能，聯(lián)合補(bǔ)腎解毒方則具有顯著的協(xié)同作用。使用合適的中藥方劑證實(shí)能有效調(diào)整慢性HBV感染時(shí)T細(xì)胞的免疫功能，這無(wú)疑為進(jìn)一步研究重建機(jī)體HBV特異性免疫和研制有效的抗HBV的免疫治療方法提供良好的科學(xué)證據(jù)和新的思路。

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