溫陽解毒化瘀顆粒對肝衰竭內毒素血癥大鼠腸道sIgA的影響*

王 軒 陳 斌 彭 杰 蘇煦初 孫克偉 李 武 周 為

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)國家中醫(yī) (肝病)臨床研究基地、湖南省中醫(yī)藥管理局重型肝炎證治研究室、國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)肝膽病重點學科 (湖南長沙，410007)

近年來胃腸屏障功能在肝衰竭發(fā)病機制中越來越被重視，研究發(fā)現其與肝衰竭的發(fā)生發(fā)展有密切關系［1，2］，對內毒素血癥形成亦有重要影響。內毒素血癥是影響肝衰竭一個重要因素，減輕內毒素血癥可改善肝衰竭患者的病情。有研究發(fā)現溫陽解毒化瘀顆?？蓽p輕內毒素血癥，從而起到抗肝衰竭效應［3］。本實驗從腸道免疫屏障方面，進一步研究溫陽解毒化瘀顆粒減輕內毒素血癥的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只，體重130～150g，由湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物中心提供。動物合格證號:SCXK(湘)2009-0004。

1.2 藥物與試劑 溫陽解毒化瘀顆粒由茵陳、白術、丹參、苡米各30g，附片10g，赤芍60g組成，藥物均采用中藥濃縮顆粒劑 (華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號分別為:1108001S、 1108002S、 1110001S、 1109002S、 1109002S、1108001S)。D-半乳糖胺 (南通通呂生物制品有限公司，批號:20111106)使用時配成20%溶液，并用1M的NaOH調pH至7.0。終點基質鱟試劑盒 (廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，批號:110620)。大鼠sIgA ELISA試劑盒 (美國RD公司，批號:201110)

1.3 儀器 UV-1800型紫外分光光度計 (日本島津公司)，HHW21420S型電熱恒溫水溫箱 (上海躍進醫(yī)療器械廠)，AY120型電子天平 (日本島津公司)。Thermo Scientific MK3型酶標儀 (Thermo Fisher公司)

1.4 模型建立、分組與給藥 60只SD大鼠隨機分為正常組(10只)、模型組 (25只)和實驗組 (25只)。造模法參照文獻［4，5］，并加以改進，模型組、實驗組大鼠分別稱重后給予D-半乳糖胺2.0g/kg一次性腹腔注射，24小時后成模;正常組大鼠給予等劑量生理鹽水腹腔注射。每公斤體重給藥量:按照人與大鼠體表面積關系換算大鼠的日用量:中藥生藥29.98g，使用時，用蒸餾水將中藥顆粒配成濃度為0.169g/ml的溶液，將乳果糖配成體積分數為20%的溶液，將雙歧三聯活菌配成濃度為0.0084g/ml的溶液;實驗組大鼠給予溫陽解毒化瘀方顆粒劑;正常組與模型組大鼠給予等劑量生理鹽水。灌胃量20ml·kg－1·d－1，于造模前4天開始灌胃給藥，2次/d，直至動物處死。

1.5 觀察指標 ①內毒素檢測:抽取門靜脈血1ml裝入無熱原抗凝管，3000 rpm，離心1分鐘，取上清血漿標本，行內毒素檢測，具體方法參照終點基質鱟試劑盒說明書。②觀察肝組織病理學改變:取右葉肝組織，生理鹽水洗凈血液，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，逐級脫蠟，HE染色，光鏡下觀察肝臟的病理學改變。③腸道sIgA含量檢測:取靠近回盲部小腸10cm，縱向剖開，無菌生理鹽水沖洗腸內容物，輕刮腸黏膜表面黏液于EP管中，再加入0.01mol/L PBS 1ml，充分混勻，3000轉/分，離心15分鐘取上清液，以ELISA法檢測腸道sIgA，并以雙縮脲法測定黏液蛋白含量，以計算每毫克黏液蛋白中腸道sIgA的含量。

2 結果

2.1 各組大鼠肝門靜脈內毒素檢測結果 與正常組相比，模型組大鼠12小時門靜脈內毒素水平稍開始升高，至24小時明顯升高，與正常組比較，差異有顯著性意義 (F=8.52，P＜0.01);實驗組大鼠門靜脈內毒素水平較模型組均降低，12小時與模型組比較，差異無顯著性意義，24小時與模型組比較，差異有顯著性意義 (F=3.97，P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠門靜脈內毒素水平比較 (±s，EU/ml)

表1 各組大鼠門靜脈內毒素水平比較 (±s，EU/ml)

與正常組同時段比較，△P＜0.05;與模型組24h比較，*P＜0.05

組別 n 內毒素12h 24h正常組10 0.317±0.239 0.317±0.239模型組 10 0.460±0.317 0.921±0.426△實驗組 10 0.450±0.272 0.603±0.349*

2.2 各組大鼠肝組織病理學結果 按損傷范圍不同給予積分;“－”為組織結構正常，0分;“+”為可見肝細胞點狀壞死，1分;“++”為肝細胞壞死范圍＜1/3肝小葉，2分;“+++”為肝細胞壞死范圍占肝小葉1/3～2/3，3分;“++++”為肝細胞壞死范圍＞2/3肝小葉，4分。

與正常組相比，模型組大鼠12小時肝臟病理改變明顯加重，差異有顯著性意義 (Z=－4.119，P＜0.05);24小時改變更明顯 (Z=－4.091，P＜0.01)。實驗組大鼠肝組織病理改變程度較模型組輕，12小時與模型組比較差異無顯著性意義;24小時時肝病理改變程度較模型組減輕 (Z=－2.804，P＜0.05)，差異有顯著性意義。見表2。

2.3 各組大鼠腸道sIgA檢測結果 與正常組相比，模型組12小時腸道sIgA明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義 (F=5.02，P＜0.05);之后出現回升。實驗組也表現出一樣的變化趨勢，12小時與模型組比較，差異無顯著性意義;24小時時腸道sI-gA水平較模型組明顯升高 (F=5.34，P＜0.05)。見表3。

表2 各組大鼠肝組織病理評分比較 (分)

表3 各組大鼠腸道sIgA檢測結果比較(±s，μg/mg)

表3 各組大鼠腸道sIgA檢測結果比較(±s，μg/mg)

與正常組同時段比較，△P＜0.05;與模型組24小時比較，*P＜0.05

sIgA 12h 24h正常組組別 n 10 2.624±1.177 2.624±1.177模型組 10 1.575±0.597△ 2.226±0.722實驗組 10 1.637±0.588 3.815±1.045△＊

3 討論

內毒素是革蘭陰性細菌細胞壁外層成分，其對人體的毒性成份是脂多糖 (LPS)。腸道是機體最大的細菌和內毒素貯庫。肝衰竭時患者腸道菌群發(fā)生紊亂，腸道各正常菌群之間的平衡遭到破壞，專性厭氧菌顯著減少，革蘭陰性桿菌顯著增多，當這些細菌死亡時，可釋放大量內毒素，從而導致內毒素的來源大量增加。同時因門靜脈高壓，腸黏膜瘀血、水腫、糜爛、腸黏膜及血管通透性增加，腸黏膜屏障功能減弱，大量內毒素經腸黏膜下微血管入血，加之肝臟受損嚴重，肝枯否細胞功能紊亂，內毒素得不到有效清除，形成ITEM。

腸道免疫屏障由腸黏膜上皮細胞分泌的sIgA等抗體以及黏膜下淋巴組織共同組成，參與機體免疫監(jiān)控和免疫防御，對阻止內毒素的吸收有重要的作用。固有層淋巴細胞分泌的IgA和IgM可調節(jié)腸上皮細胞的凋亡，對腸道菌群也起到重要的調節(jié)作用，且固有層淋巴細胞中漿細胞分泌的sIgA也對腸道的免疫功能起到了重要的保護作用。肝衰竭時機體免疫功能下降，腸黏膜上皮細胞sIgA分泌減少［6，7］，從而增加了細菌的黏附的機會，進而使細菌及內毒素移位更易發(fā)生。說明腸黏膜IgA水平高低與腸黏膜免疫屏障損傷密切相關［8］。

溫陽解毒化瘀顆粒經前期臨床應用，證實其降低肝衰竭患者病死率和促進黃疸消退等療效良好［9，10］。該方由茵陳、白術、附片、丹參、赤芍、苡米組成，赤芍具有清熱解毒、活血化瘀的功能，方中重用赤芍以加強解毒化瘀的功效，附片大辛大熱有溫補脾腎的功效，并可防方中藥物寒涼太過，兩者寒熱并用為君藥;配伍茵陳、丹參為臣藥，以配合君藥加強清熱化濕，活血化瘀的功效;再佐以白術、苡米以燥濕健脾益氣，防諸藥損傷脾胃?，F代研究表明茵陳、白術、附子、苡米均有抗炎、增強免疫的作用。

本實驗證實溫陽解毒化瘀顆粒能增加腸道sIgA的分泌，提示該方有增強腸道免疫屏障的作用，同時發(fā)現模型組大鼠的腸道sIgA分泌量在肝損傷初期顯著減少，24小時時開始有所恢復，說明肝衰竭初期腸道免疫屏障受損嚴重，而實驗組大鼠腸道sIgA分泌量則多于模型組，說明該方減輕內毒素血癥的機制與該方增加腸道sIgA分泌，減少內毒素的吸收有密切關系，提示增加腸道sIgA分泌是溫陽解毒化瘀顆粒改善ITEM的機制之一。另外，模型組大鼠24小時腸道sIgA有所升高，但內毒素水平反而沒有下降，提示肝衰竭腸道IETM的調節(jié)機制較為復雜，如肝枯否細胞的參與等［11］，可以作為該方的作用靶點之一進行進一步研究。

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