銀杏葉提取物對糖尿病大鼠心肌保護作用的研究

王春艷 田晶

吉林醫藥學院基礎醫學院生理學教研室,吉林 吉林 132013

1. 材料與方法

1.1 實驗動物 體重180-220g的Wistar大鼠40只。

1.2 主要儀器與試劑

全自動生化分析儀；PCR反應儀；DAB顯色試劑盒；UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒；一抗(兔抗鼠，結締組織生長因子)；鏈脲佐菌素（STZ）；銀杏葉提取物注射液。

1.3 分組、模型制備及給藥 40只Wistar大鼠適應性喂養1w，1w后大鼠隨機分為3組：正常組10只，模型組15只，治療組15只。按STZ 50mg/kg體重，一次性腹腔注射。7d后，大鼠表現為多飲、多食、多尿和體重減輕，連續兩次測定空腹血糖≥11.1mmol/L,非空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖3+以上者列入糖尿病模型。造模過程中，正常組無死亡，模型組和治療組分別死亡3只和2只，原因可能是低血糖等。模型組和治療組各挑選一般狀態較好的10只繼續實驗。正常組、模型組經胃給予生理鹽水2ml/kg，治療組經胃給予銀杏葉提取物注射液4mg/kg，1次/日，持續12w。

1.4 方法

12w末大鼠斷頭，取血，全自動生化分析儀測定各組大鼠血糖(BG)、總膽固醇（TC）、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。剖殺大鼠，剪取左心室心尖處心肌組織，浸于4%多聚甲醛中固定，進行常規石蠟包埋切片，免疫組化方法觀察心肌組織中CTGF的表達，棕黃色顆粒產物為陽性標記。將剩余新鮮心肌組織保存于低溫冰箱，采用RT-PCR法檢測CTGF- mRNA的表達。

2. 統計學分析

所有數據用SPSS18.0統計軟件包進行分析。計量資料以 ±s表示，進行方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

3. 結果

3.1 模型組與正常組相比，模型組BG、TC、TG、LDL均明顯升高，HDL明顯降低（P<0.05），差異有統計學意義。治療組與模型組相比，各項指標均有改善，BG、TC、TG、LDL下降，HDL有所升高（P<0.05），差異有統計學意義。治療組與正常組比較，BG、TC、TG、LDL等生化指標仍略高于正常組，HDL仍比正常組低（表1）。

表1 銀杏葉提取物對大鼠血液生化指標的影響（±s）

表1 銀杏葉提取物對大鼠血液生化指標的影響（±s）

注：與正常組比較,#:P<0.05；與模型組比較,*:P<0.05

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3.2 正常組心肌細胞內可見少量分布均勻的棕黃色顆粒(圖1-A)。模型組心肌細胞膜和胞漿內均可見濃密的深棕黃色顆粒，CTGF的表達顯著升高(圖1-B)。與模型組比較，治療組心肌細胞CTGF的表達明顯降低，但仍略高于正常組(圖1-C)。

圖1 各組大鼠心肌組織免疫組化染色（400×）

3.3 與正常組比較,模型組心肌組織CTGFmRNA表達明顯增高（P<0.05）,差異有統計學意義。與模型組相比,治療組心肌組織CTGFmRNA表達明顯降低(P<0.05),差異有統計學意義。（表2，圖2，圖3）。

圖2 各組大鼠心肌組織中CTGF的RT-PCR電泳圖

表2 各組心肌組織中CTGFmRNA表達水平的比較（±s）

表2 各組心肌組織中CTGFmRNA表達水平的比較（±s）

注：與正常組比較,#:P<0.05；與模型組比較,*:P<0.05；

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圖3 各組大鼠心肌組織中CTGF mRNA表達水平比較

4. 討論

糖尿病誘發的高血糖和高血脂狀態可以破壞心肌細胞功能。Ren J等人[1]將正常大鼠的心肌細胞浸于高糖培養液中，24h即發現心肌細胞功能受損。脂肪代謝障礙會使血漿中脂類物質含量增加，血液黏稠度增加，脂類物質還會粘附在血管內皮細胞上，最終導致動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的發生。本實驗中，造模組大鼠BG、TC、TG、LDL明顯升高，而HDL明顯降低。治療組BG、TC、TG、LDL降低，HDL升高。結果提示，銀杏葉提取物可以降低血糖、血脂，改善糖、脂代謝，減輕高血糖，高血脂對心肌細胞的破壞，對心肌具有一定的保護作用。

CTGF屬于即刻早期基因CCN基因家族和胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白超家族，是一種具有促進細胞增殖，細胞外基質（ECM）合成，細胞黏附分子表達等多種生物活性的細胞因子。CTGF是TGF-β的一種下游元件，在結締組織形成過程中，TGF-β誘導CTGF的表達，CTGF的表達又進一步介導TGF-β的部分生物作用。TGF-β可誘導心肌成纖維細胞、表皮成纖維細胞分泌CTGF，而CTGF又作用于相關細胞，參與TGF-β對這些細胞的促增生和促ECM合成。CTGF在正常生理狀態下少量表達，且主要表達于間質細胞中[2]。本實驗中發現，糖尿病大鼠心肌組織中CTGF基因及蛋白均呈強陽性表達。

綜上所述，在糖尿病動物模型中CTGF呈現高表達狀態，其中高血糖狀態和TGF-β是誘導CTGF基因高表達的重要因素。CTGF對細胞增殖和基質積聚具有特殊生物學活性。在本實驗中發現，銀杏葉提取物可以降低糖尿病大鼠心肌細胞CTGFmRNA及蛋白的表達，減弱TGF-β誘導組織纖維化的效應，抑制心肌纖維化，提高心室順應性，改善心肌細胞舒縮功能，延緩充血性心力衰竭的發生，對糖尿病心肌具有一定的保護作用，為糖尿病性心肌損傷的抗纖維治療提供了更特異的藥物作用靶點。

[1]Ren J,Gantant GA,Miller RE.et al. High extracelluar glueose impairs cardiac E-C coupling in a glycosylation-dependent manner.Am J Physiol,1997,273 (12):H2876-2883.

[2]Frazier KS,Paredes A,Duber P, et al. Connective tissue growth factor express in the rat remnant kidney model and association with tubular epithelialcell undergoing transdifferentiation.Vet Pathol,2000,37:328-335.