高效液相色譜法構(gòu)建黃連上清丸指紋圖譜

張少君 車燕妮 蘇秀娟 張凌斐 張吉芬

威海市疾病預(yù)防控制中心，山東 威海 264003

應(yīng)用指紋圖譜監(jiān)控中藥材或中成藥的質(zhì)量的穩(wěn)定性和專一性在國(guó)際上已成為一種趨勢(shì)[1]，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）[2]、歐共體藥審委（EMEA）[3]和世界衛(wèi)生組織（WHO）均要求提供植物藥產(chǎn)品的指紋圖譜以保證其質(zhì)量的一致性。2000年，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)了《中藥注射劑指紋圖譜的技術(shù)要求（暫行）》，確立了指紋圖譜的法定地位。

黃連上清丸是著名的解表藥，主要功能是清熱通便，散風(fēng)止痛[4]。中國(guó)藥典（2010版）采用薄層掃描法控制其中鹽酸小檗堿的含量，藥方中黃連和黃柏兩者都含有小檗堿，但二者功效不同，只測(cè)定小檗堿的含量不能真實(shí)反映藥品的質(zhì)量。黃連上清丸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其指紋圖譜尚未見報(bào)，本文利用高效液相色譜（HPLC）法研究構(gòu)建指紋圖譜及數(shù)字化指紋譜，以便較全面有效地評(píng)價(jià)控制該制劑的質(zhì)量，供企業(yè)鑒別質(zhì)量參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

高效液相色譜系統(tǒng)（島津，日本）。色譜柱（250×4.6mmI.D.，5 m，安捷倫，美國(guó)）。紫外分光光度計(jì)（UV2401PC，島津，日本）；分析天平（Sartorius，BS210S，德國(guó)）；超聲波清洗器（Cole-Pharmer, USA）。

色譜純甲醇（Caledon Laboratories, Canada），乙腈（Fisher Scientific, UK），乙酸（科密歐，天津，中國(guó)）和三乙胺（Tedia, USA）用于樣品的制備和配制流動(dòng)相。所有樣品的制備均使用超純水。鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-200208）和黃芩苷（批號(hào)：110715-200514）均購(gòu)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所。黃連上清丸隨機(jī)購(gòu)于全國(guó)各醫(yī)院或藥房（見表1）。

表1 黃連上清丸的生產(chǎn)廠家及批號(hào)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的制備

將黃連上清丸水丸研成粉末，稱取100 mg，用70%甲醇＋30% 0.2M鹽酸溶液超聲提取60 min；再用5,000 r/min離心10 min，0.45μm濾膜過濾，備用。

1.2.2 高效液相色譜的分析條件

實(shí)驗(yàn)采用雙泵洗脫梯洗脫：流動(dòng)相A相（甲醇-水-乙酸-三乙胺=10:89.1:0.8:0.1），B相（甲醇-水-乙酸-三乙胺=89.1:10:0.8:0.1）[5]；洗脫梯度：0～10 min: 5～20%B, 10～50 min: 20～55% B, 50～70 min: 55～100% B,70～80 min: 100% B。流速0.9 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫40℃。上樣量20μl。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2005年版），《中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的規(guī)定，進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的內(nèi)容包括準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限、定量限和線性。

2.1.1 準(zhǔn)確度

標(biāo)準(zhǔn)樣品中小檗堿和黃芩苷的含量分別為0.058mg/mL和0.308mg/mL,再分別加入0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品,用6個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià),測(cè)得平均回收率分別為96.8%,99.5%,RSD分別為0.9%，0.7%。

2.1.2 精密度

取同一樣品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得小檗堿、黃芩苷保留時(shí)間的RSD分別是0.4232%和0.4738%，具有較高的精密度。

2.1.3 檢測(cè)限和定量限

黃連上清丸在信噪比為3:1的條件下檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限都低于0.1μg/mL。以信噪比為10:1時(shí)相應(yīng)的濃度進(jìn)行確定，定量限為1μg/mL。

2.1.4 線性

分別將儲(chǔ)備液稀釋成0.001mg/mL-1.0mg/mL制成系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用HPLC法進(jìn)行線性回歸分析。鹽酸小檗堿0.001～1mg范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=111702327x-146629（R2=0.9998，n=7）；黃芩苷在0.001mg～1.5mg范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=32382153x-18828（R2=0.9999，n=7）。

方法學(xué)評(píng)價(jià)的結(jié)果證明此方法的各項(xiàng)指標(biāo)符合指紋圖譜的要求，適合本研究的應(yīng)用。

2.2 HPLC指紋圖譜的構(gòu)建

為有效控制不同廠家黃連上清丸中有效成分的含量及分布，本文根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》建立了HPLC指紋圖譜。當(dāng)采用1.2.3的分析條件時(shí)，主要色譜峰基本達(dá)到基線分離，指標(biāo)成分鹽酸小檗堿與其相鄰色譜峰的分離度很好。12個(gè)黃連上清丸圖像式指紋圖譜見圖1，每個(gè)記錄曲線均有50多個(gè)峰，樣品間的比較和描述比較困難，因而從這些色譜峰中挑選出在樣品中均穩(wěn)定出現(xiàn)的峰，即共有峰，黃連上清丸共設(shè)定了17個(gè)共有峰(圖2)。一組樣品中的共有峰，代表了一類生物樣品的共性，體現(xiàn)了該品種的特性，是與其他品種的區(qū)別之處。從而構(gòu)成了該生物體所特有的指紋，也稱為特征指紋。特征指紋峰的差異反映了同一品種生物體因不同產(chǎn)地、不同采收期等因素造成的質(zhì)量差異，可用作原料藥材、原料藥、中間體及成藥的質(zhì)控參數(shù)。為保障特征指紋峰的代表性，共有峰的峰面積至少占總峰面積的60%。從圖象式指紋譜上可以看出主要成分的濃度的整體分布、保留時(shí)間和共有峰的含量大致差異。但僅通過圖像式指紋譜難以對(duì)12個(gè)樣品做出定量的判斷，而且圖像式指紋譜本身也受操作因素的影響，從而導(dǎo)致較低的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

圖1 黃連上清丸圖象式指紋譜Fig. 1 HPLC fingerprint of 12 coptis bolus for clearing the upper heat samples

圖2 黃連上清丸的共有峰Fig. 2 Common peaks of coptis bolus for clearing the upper heat

2.3 黃連上清丸高效液相色譜數(shù)字化指紋譜

數(shù)字化色譜指紋譜是將復(fù)雜難辨的圖譜轉(zhuǎn)為直觀的數(shù)字，建立一系列參數(shù)和相應(yīng)的一整套比較規(guī)則和計(jì)算公式，有效地改善了原始色譜圖的波動(dòng)性，使色譜圖之間的直觀比較改變?yōu)閿?shù)據(jù)之間的比較，從而增強(qiáng)了樣品相互間的可比性。

洪筱昆教授最早創(chuàng)立了數(shù)字化指紋譜法，以相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為主要參數(shù)，計(jì)算指紋譜重疊率、相似度和n強(qiáng)峰、特征指紋差異率并繪制特征指紋曲線等。本實(shí)驗(yàn)組以此為基礎(chǔ)并對(duì)數(shù)字化指紋圖譜的表現(xiàn)形式進(jìn)行了改進(jìn)。

2.3.1 特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

黃連上清丸設(shè)定以鹽酸小檗堿作為參照峰，因它它是中藥的主要有效成分、它位于譜圖的中央位置而且與周圍峰有良好的分離度，并在12個(gè)樣品中穩(wěn)定出現(xiàn)，且與前后兩色譜峰分離度較好。其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積設(shè)為1.00，其他共有峰的保留時(shí)間及峰面積分別與之相比，得到了特征指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.357～0.959%之間，均在方法誤差范圍內(nèi)，認(rèn)為對(duì)應(yīng)色譜峰均為同一組分。各廠家黃連上清丸樣品中各組對(duì)應(yīng)洗脫峰相對(duì)峰面積的RSD在66.020%～112.281%之間，遠(yuǎn)大于10%，超出了方法誤差，認(rèn)為對(duì)應(yīng)組分含量差異顯著。

2.3.2 特征指紋峰差異率

共有峰差異率及特征指紋差異率按式（1.1）及式（1.2）計(jì)算，假定以1號(hào)樣品作為標(biāo)準(zhǔn)制劑，因?yàn)?號(hào)樣品的含量適中，其他樣品為待鑒制劑，各樣品的差異率及總差異率見表2。可以看出2號(hào)樣品、5～7號(hào)、9～12號(hào)樣品與S1相似程度較高，而3號(hào)、4號(hào)、8號(hào)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品間均存在較大差異。

AI鑒—待鑒樣品中某個(gè)峰的歸一化面積值；AI標(biāo)—標(biāo)準(zhǔn)樣品中某個(gè)峰的歸一化面積值；n—特征指紋譜峰的總數(shù)。

2.3.3 特征指紋曲線

黃連上清丸樣品的特征指紋曲線（圖3）可以直觀地反映不同樣品之間的近似程度，從整體角度看2號(hào)、5～7號(hào)、9～12號(hào)樣品與作為標(biāo)準(zhǔn)樣品S1相似程度很高，而3號(hào)、4號(hào)、8號(hào)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品間均存在很大差異，這與總差異率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 黃連上清丸特征指紋曲線Fig. 3 Characteristic fingerprint curve of coptis bolus for clearing the upper heat samples

2.3.4 數(shù)字化指紋譜的改進(jìn)

本實(shí)驗(yàn)組建立的數(shù)字化指紋圖譜以洪教授的數(shù)字化指紋譜法為基礎(chǔ)，改進(jìn)了原有數(shù)字化指紋譜的表現(xiàn)形式，不僅包括相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，還包括它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及差異率，使樣品間的量化比較一目了然。所反映的化學(xué)成分包括了研究對(duì)象的重要指標(biāo)成分，體現(xiàn)了指紋圖譜的系統(tǒng)性；指紋圖譜中反映的化學(xué)成分信息（如保留時(shí)間或遷移值）具有高度選擇性，這些成分之間的順序、比值在一定范圍內(nèi)是固定的，體現(xiàn)了特征性；在樣品制備方法、分析條件、結(jié)果處理等環(huán)節(jié)規(guī)范操作的前提下，由不同的操作者作出的指紋圖譜，其誤差在允許范圍內(nèi)，保證了指紋圖譜的使用具有通用性和實(shí)用性(表2）。

3 結(jié)語

本文構(gòu)建了黃連上清丸的圖象式指紋圖譜和數(shù)字化指紋譜。從圖象式指紋譜上可以直觀地判斷不同樣品共有峰的含量差異比較顯著，這是由于原料、加工過程等多種因素引起。在數(shù)字化指紋譜中，通過對(duì)不同參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，推斷出每個(gè)廠家都按規(guī)定投入了十七味原藥材，而藥材的品質(zhì)以及藥材的投入量卻有顯著差異。該方法可借鑒用于其他不同廠家不同批次的制劑鑒定與評(píng)價(jià)參考。

表2 黃連上清丸改進(jìn)后的的數(shù)字化指紋圖譜

[1]Manhua Liu, Pew-Thian Yap, Invariant representation of orientation fields for fingerprint indexing. Pattern Recognition, 2012, 45(7):

2532-2542.

[2]FDA Guidance for Industry-Botanical Drug Products (Draft Guidance).US Food and Drug Administration, Rockville, 2000, pp.18 22.

[3]Note for Guidance on Quality of Herbal Medicinal Products.European Medicines Agency, London, 2001.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典, 2010年版，一部[S]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[5]Shaojun Zhang, Fan Ouyang, Changhai Wang, and Ming Gu,Fingerprint of Tablet of Corydalis tuber for Alleviating Pain by HPLC.Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 31: 452-464, 2008。

[6]洪筱坤，王智華. 中藥數(shù)字化色譜指紋譜[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2003.