乳腺癌淋巴管密度的臨床病理意義

張云虹 王小玲

淋巴道轉移是癌癥的主要死亡原因之一，它是預后不良的重要危險因素，也是確定治療方案和手術方式的重要指標。乳腺癌是我國女性常見的惡性腫瘤之一，淋巴管是乳腺癌細胞轉移到腋窩淋巴結的主要途徑。淋巴管和血管伴行生長，但在結構和功能方面卻有著明顯不同，以前對腫瘤淋巴管的研究由于缺乏特異性的淋巴管內皮標記物而遠滯后于對腫瘤血管的研究。新近發現的抗M2A的單克隆抗體D2-40能高度特異性的標記淋巴管內皮細胞［1，2］。本文通過免疫組化法研究D2-40標記的乳腺癌淋巴管的病理學特征，定量分析D2-40陽性微淋巴管密度，探討其在乳腺癌淋巴結的轉移中的臨床意義及其與其他病理參數之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集衡水市第二人民醫院2008年5月至2011年8月乳腺癌患者術后組織石蠟標本50例，另選取同期乳腺纖維腺瘤標本30例作為對照組。患者均為女性，年齡28～78歲，中位年齡45歲。50例中，其中浸潤性導管癌41例，浸潤性小葉癌6例，導管內癌2例，黏液腺癌1例。有淋巴結轉移的30例，無淋巴結轉移的20例。腫瘤直徑0.6～8 cm，平均2.6 cm。病理分級：Ⅱ級7例，Ⅱ～Ⅲ級22例，Ⅲ級12例。臨床分期：Ⅰ期的8例，ⅡA期的22例，ⅡB期的17例，ⅢA期的3例。所有病例術前均未接受放化療，均有完整的臨床病理資料。

1.2 試劑及免疫組化方法 主要試劑鼠抗人D2-40免疫組化單克隆抗體，金·多聚賴氨酸粘附玻片，UltrasensitiveTMSP超敏試劑盒(鼠/兔)，DAB顯色試劑盒，PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑);檸檬酸鹽抗原修復液(粉劑)均由福州邁新生物技術開發有限公司提供。免疫組化方法：石蠟切片4μm厚，放入烤箱烤蠟3 h;常規二甲苯、梯度酒精脫蠟至水;檸檬酸鹽抗原修復液高溫修復;切片依次滴加過氧化物酶阻斷試劑，正常非免疫動物血清，第一抗體D2-40，生物素標記的第二抗體，鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化物酶試劑;切片上滴加新鮮配制的DAB顯色試劑顯色;自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。

1.3 免疫組化結果判斷 D2-40特異性的定位于淋巴管的內皮細胞，以胞漿或胞膜呈現清晰的棕黃色顆粒為陽性表達。D2-40標記的微淋巴管密度的判定采用Fox等［3］報道的方法先在低倍鏡下(×100)選取脈管數目最多的2個“熱點”，然后在高倍鏡(×400)下觀察每個熱點的5個視野，計數其脈管數目，但應除外管腔直徑＞8個紅細胞或管壁有平滑肌存在的脈管，最后再計算2個熱點，5個視野的平均脈管數目。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間計量資料均數比較采用t檢驗，相關性分析采用person相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 D2-40標記的良惡性乳腺組織中的淋巴管形態特征及分布 D2-40陽性的淋巴管內皮細胞的胞漿或胞膜內可見棕黃色顆粒。光鏡下D2-40染色陽性的淋巴管具有不規則形狀，由單層內皮細胞排列而成，有空隙，無厚壁結構，管腔中無紅細胞。乳腺癌癌周組織內淋巴管較豐富，管壁薄，管腔扁大(圖1)，可有較多皺褶，可見脈管瘤栓(圖2);周圍乳腺組織內淋巴管也較多，管壁也很薄，管腔大且擴張(圖3);乳腺癌中心區淋巴管少且小，管腔狹窄(圖4)，甚至呈條索狀，發育差;乳腺纖維腺瘤中的淋巴管也少，管腔狹小(圖5)，乳腺肌上皮細胞D2-40也呈陽性表達(圖6)。

圖1 乳腺癌癌周組織內淋巴管豐富，管壁薄，管腔扁大(SP×100)

圖2 乳腺癌癌周組織內淋巴管扁大擴張，可見脈管瘤栓管(SP×100)

圖3 周圍乳腺組織內淋巴管豐富，管壁薄，管腔大且擴張(SP×100)

圖4 乳腺癌中心區淋巴管數量少，管腔小且狹窄，其中一管腔內可見淋巴細胞(SP×100)

圖5 乳腺纖維腺瘤中淋巴管數量少，管腔狹小(SP×40)

圖6 乳腺纖維腺瘤中導管肌上皮細胞D2-40染色陽性(SP×40)

2.2 乳腺癌癌周、乳腺周圍及中心區的微淋巴管密度比較50例乳腺癌中有38例D2-40陽性，30例乳腺纖維腺瘤中有10例D2-40陽性，2組陽性率(38/50，10/30)相比差異有統計學意義(U=3.241，P＜0.05)。乳腺癌癌周組織微淋巴管密度為8.60～33.50個，平均(21±6)個;乳腺癌中心區微淋巴管密度為4.20～13.67個，平均(6±4)個;周圍乳腺組織微淋巴管密度為7.13～25.80個，平均(17±8)個;乳腺纖維腺瘤微淋巴管密度為5.30～12.50個，平均為(7.2±2.4)個。乳腺癌癌周區微淋巴管密度明顯高于中心區和纖維腺瘤組，差異有統計學意義(t=16.09，P ＜0.05;t=12.01，P ＜0.05)。周圍乳腺組織的微淋巴管密度明顯高于中心區和纖維腺瘤組，差異有統計學意義(t=14.67，P ＜0.05;t=10.23，P ＜0.05)。乳腺癌癌周的微淋巴管密度明顯高于周圍正常乳腺組織的微淋巴管密度，差異有統計學意義(t=7.92，P＜0.05)。乳腺癌中心區的微淋巴管密度和乳腺纖維腺瘤組比較差異無統計學意義(t=0.704，P=0.488)。

2.3 乳腺癌癌周、周圍乳腺及中心區的微淋巴管密度與臨床病理參數之間的相關性 乳腺癌癌周和周圍乳腺組織的微淋巴管密度與腫瘤的大小，臨床分期及淋巴結轉移情況密切相關(P ＜0.05)，與患者的年齡、組織學分型及 ER、PR、C-erbB2、Ki-67、VEGF、P53等臨床病理參數無明顯相關性(P ＞0.05)。乳腺癌中心區的微淋巴管密度與這些臨床病理參數無明顯相關性(P ＞0.05)。見表1～3。

3 討論

惡性腫瘤中血道和淋巴道轉移是腫瘤細胞轉移的重要途徑，而腫瘤細胞的轉移和侵襲又是癌癥患者死亡的重要原因之一。乳腺癌早期以淋巴道轉移為主，因而對腫瘤淋巴管的研究也就顯得尤為重要。但由于缺少特異性的淋巴管內皮細胞標記物，對腫瘤淋巴管的研究一直滯后于對腫瘤血管的研究。以前報道過的淋巴管內皮標記物有血管內皮生長因子-3(VEGFR-3)，淋巴管內皮細胞透明質酸受體-1(LYVE-1)，Podoplanin等［4］，但在以后的研究中發現這些標記物的特異性都較差，因而制約了對腫瘤淋巴管的研究。新近發現的D2-40是一種抗M2A癌胚膜抗原的IgG2a型的鼠來源的單克隆抗體，其標記淋巴管內皮細胞的特異性和敏感性均高于其他的淋巴管內皮標記物。目前大部分的研究結果證實了D2-40能高度特異的標記正常和腫瘤組織中的淋巴管內皮細胞，可用于免疫組化檢測冷凍和石蠟包埋組織病理切片中的淋巴管內皮細胞，并且可以檢測多種惡性腫瘤的淋巴管侵襲［1，2］。

表1 乳腺癌癌周LMVD與臨床病理參數的相關性

表2 周圍乳腺組織LMVD與臨床病理參數的相關性

表3 乳腺癌中心區LMVD與臨床病理參數的相關性

本研究通過對50例乳腺癌和30例乳腺纖維腺瘤的微淋巴管的標記和計數發現乳腺癌組織周邊及離癌組織較遠的正常乳腺組織內都存在較多的淋巴管，且乳腺癌周邊的淋巴管密度較正常乳腺組織內的淋巴管密度高。癌組織周邊及離乳腺癌組織較遠的正常乳腺組織內的淋巴管管壁薄，管腔扁且大，可見較多皺褶，乳腺癌中心區組織內也存在一些淋巴管，但數量很少且管腔小，發育差，有的甚至閉鎖呈條索狀，這與一些學者的觀點是一致的［5］。乳腺纖維腺瘤組織中也存在一些淋巴管，但數量遠較乳腺癌周邊及離乳腺癌組織較遠的正常乳腺組織內的少，且管腔小，與文獻報道［6］一致。同時在研究微淋巴管密度與乳腺癌組臨床病理參數時發現乳腺癌周邊及周圍乳腺組織內的微淋巴管密度和淋巴結的轉移情況，腫物的大小，臨床分期密切相關，而與患者的年齡、組織學分型及 ER、PR、C-erbB2、Ki-67，VEGF，P53等臨床病理參數無明顯相關性，可能與標本量較小有關。

乳腺癌在早期是以淋巴結轉移為主的，在腫瘤細胞發生淋巴結轉移之前，它必須先進入淋巴管。乳腺癌組織周邊及遠離癌組織的正常乳腺組織中的淋巴管數目的增加可以增加淋巴管的表面積，進而使腫瘤細胞更容易入侵，淋巴管數目的增加以及淋巴管腔的擴張，又導致了淋巴管密度的增加，這可能是腫瘤淋巴道轉移的形態學基礎及LMVD增加的機制［6］。淋巴管的增生及擴張為癌細胞向淋巴結的轉移提供了便利的途徑，所以研究乳腺癌的淋巴管密度的臨床病理意義對探討淋巴管的生成機制具有一定的價值，并且可以對乳腺癌預后的判斷以及抗淋巴結轉移的治療提供理論和實驗依據。

1 Yonemura Y，Endou Y，Tabachi K，et al.Evaluation of lymphatic invasion in primary gastric cancer by a new monoclonal antibody，D2-40.Hum Pathol，2006，37：1193-1199.

2 Takanami I.Lymphatic microvessel density using D2-40 is associated with nodal metastasis in non-small cell lung cancer.Oncol Rep，2006，15：437-442.

3 Fox SB，Leek RD，Weekes MP，et al.Quantitation and prognostic value of breast cancer angiogenesis：comparison of microvessel density，Chalkley count，and computer image analysis.JPathol，1995，177：275-283.

4 張海娥，莊建基，楊帆.惡性腫瘤淋巴管生成與轉移的研究進展.第四軍醫大學學報，2007，28：479-480.

5 謝曉冬，屈淑賢，鄭振東，等.人乳腺癌中D2-40標記的微淋巴管密度與淋巴結轉移關系的研究.中國腫瘤臨床，2008，35：810-813.

6 許丙輝，薛亞靜，李恒力，等.乳腺癌淋巴管密度與血管內皮生長因子相關性分析.河北醫藥，2011，33：1775-1777.