循環活化血小板的檢測在腦梗死患者診斷與治療中的臨床研究

劉京偉

(山東省臨沂市沂水中心醫院，山東臨沂276400)

腦梗死(cerebralinfarction，CI)多在動脈粥樣硬化基礎上發生，CI的重要病理基礎為血管內血栓形成。血小板活化與腦梗死的發生、發展及預后密切相關。由于纖維蛋白原受體(fibrinogenreceptor，FBI－R)和P－選擇素均可作為血小板活化的分子標志物，為此，觀察121例CI患者循環活化血小板膜表面FBI－R和P－選擇素的變化情況，旨在探討其與CI之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象:入選121例CI患者均符合第四屆全國腦血管病學術會議通過的診斷標準[1］。根據CT報告將其分為大面積梗死組(＞5cm2)41例，小面積梗死組(≤5cm2)52例，以及腔隙性梗死組28例，其中男73例，女48例，平均年齡(60.8±10.6)歲。對照組為同期體檢未發現異常的健康人70例，其中男42例，女28例，平均年齡(60.4±11.3)歲。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器:FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2.2 主要試劑:①單克隆抗體(monoclonalanti body，McAb)包括異硫氰酸熒光素(fluoreszeinsothiocyanat，FITC)標記的抗血小板纖維蛋白原受體(FIB－R)的McAb(PAC－1FITC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的抗P－選擇素的 McAc(CD62PPE)、Peridinin葉綠素蛋白(PerCP)標記的抗血小板糖蛋白Ⅲa的McAb(CD61PerCP)、MIgGPE為藻紅蛋白標記的鼠IgG，以上均為美國BD公司產品。②流式細胞儀熒光校準微球，美國BD公司產品。

1.2.3 精氨酰－天冬氨酰－絲氨酰多肽(ArgGly－Asp－Ser，RGDS)(FIB－R阻斷劑)、人工合成的RGDS肽，為美國Sigma公司產品。

1.3 方法

1.3.1 標本采集:所有CI患者急性發作24h內采集肘靜脈血2mL，其余均為晨起空腹采集，經106mmol/L枸櫞酸鈉抗凝。

1.3.2 抗血小板McAc免疫熒光染色:在陰性對照管中加入PAC－1FITC、MIgGPE、RGDS和CD62PPE 和CD61Per-CP各10μL測定管中加入PAC－1FITC、CD62PPE和CD61 PerCP各10μL，然后加入5μL抗凝血混勻，置室溫，避光反應20min，立即加入1%多聚甲醛(2～6℃)1mL并混勻，置4℃冰箱保存，24h內在流式細胞儀上進行檢測。

1.3.3 流式細胞術分析活化血小板:用熒光微球校準流式細胞儀后，將上述用熒光素標記的抗血小板McAb免疫熒光染色的標本在流式細胞儀上測定，記數1萬個血小板，以CD61PerCP和側向散射光雙參數設定血小板門，分析FIBR(PAC－1)和CD62P陽性血小板百分率。

1.4 統計學原理:統計學分析采用統計軟件APSS10.0For Windows，實驗數據以M(全距)表示，多組間資料分析采用方差分析檢驗。

2 結果

CI患者較對照組FIB－R表達差異有統計學意義，尤其是急性期(P＜0.01)，見表1。在不同梗死面積的梗死組之間，FIB－R表達水平差異有統計學意義(P＜0.01)，見表2。各組之間P－選擇素表達水平均無統計學意義(P＞0.05)。

表1 CI患者與對照組循環血小板膜面積FIB－R和P－選擇素的表達M %

表2 不同梗死面積CI患者循環血小板膜面積FIB－R和P－選擇素的表達M %

3 討論

腦梗死多在動脈粥樣硬化基礎上發生，動脈粥樣硬化后，由于血管壁內皮細胞受損，血管膠原暴露與血小板接觸面增加，易導致血管內血栓，在這一過程中血小板的活化起重要作用。活化血小板與靜止血小板相比，其膜糖蛋白分子的種類、數量、分布和構型等出現顯著變化，流式細胞技術作為一種高效、快速、多參數分析的先進技術，可以非常靈敏地檢測到活化血小板膜表面糖蛋白分子的變化，從而可以精確判斷血小板的功能狀態[2］。FIB－R和P－選擇素存在于血小板膜表面，是血小板活化的兩個較敏感的分子標志物。本組研究結果顯示，CI患者較對照組血小板膜表面FIB－R的表達顯著增高，FIB－R增高表明血小板處于活化狀態，并且在急性期較恢復期顯著增高，所以活化的血小板是CI的一個重要的危險因素[3］。而CI患者血小板膜表面P－選擇素的表達水平較對照組未見明顯增高，起因可能是循環血液中活化血小板膜表面P－選擇素易被清除[4］。同時Michelson等[5］還證實P－選擇素被清除的活化血小板仍能繼續循環于血液中發揮其功能。因此P－選擇素并非一種循環中脫顆粒血小板檢測的理想標志物。另外，FIB－R與CI患者的梗死面積密切相關，梗死面積越大，FIB－R也越高，預后也越差。CI患者血小板處于高度活化狀態，血小板表面質膜結合多種凝血因子，如纖維蛋白原、因子Ⅴ、因子Ⅺ等，可以使活化的血小板與中性粒細胞和/或單核細胞黏附聚集，可促進血中纖維素的形成并募集其他白細胞形成凝塊，是栓子增大，梗死面積增大，病情加重[6］。由于FIB－R增高，血小板活化，產生更多的活性物質如血栓素A2，從而加快栓子的形成。另外CI患者由于缺血、缺氧，病變部位的血管內皮細胞受損，使血管內皮的花生四稀酸轉變為前列腺素減少，而前列腺素有抗血小板聚集的功能。動態檢測CI患者的FIB－R，一方面有助于患者病情輕重程度的判定，另一方面可以了解CI患者血小板的活化情況，即時調節抗血小板治療，以便改善CI的預后。由于動脈粥樣硬化患者中動態檢測FIB－R，即時給予抗血小板治療，有助于預防CI的發生。

[1]全國第四屆腦血管病學術會議.各類腦血管病診斷要點[J］.中華神經科雜志，1996，12(6):379 －380.

[2]王建中，曹凌，賀茂林，等.流式細胞術三色分析循環活化血小板及其在卻學性腦血管病中的臨床意義[J］.中華醫學雜志，2000，80(7):499 －502.

[3]丁志祥，張樂之，王鴻利.血小板平均面積檢測的臨床意義[J］.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，2004，25(4):316－318.

[4]Michelson AD，Barnard MR，Hechtman HB， et al． In vion tracking of platelets: circulating degranulated platelets rapidly lose surface P－ selectin but continue to circulate and function［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1996， 93( 21) : 11877 － 11882．

[5]Michelson AD． Flow cyrometric assessment of glycoprotein movements in platelets［J］． Platelets，1997，8( 2) : 105 － 115．

[6]丁志祥，張樂之，凌勵.腦梗死病人平均血小板體積的改變及臨床意義[J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2003，1(11):637－638.