肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因突變與喹諾酮耐藥相關性研究

張友春，王志平

(1.淳安縣婦幼保健院，浙江 淳安 311700；2.浙江醫學高等專科學校，浙江 杭州 310053)

·基礎與臨床研究·

肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因突變與喹諾酮耐藥相關性研究

張友春1，王志平2@

(1.淳安縣婦幼保健院，浙江 淳安 311700；2.浙江醫學高等專科學校，浙江 杭州 310053)

目的：分析浙江省淳安縣肺炎克雷伯菌臨床菌株gyrA和parC基因喹諾酮耐藥決定區(QRDR)突變類型及與耐藥的相關性。方法檢測87株肺炎克雷伯菌臨床菌株對3種喹諾酮類藥物的最小抑菌濃度(MIC)，PCR擴增26株臨床菌株的gyrA 和parC基因并測序。結果87株臨床菌株對諾氟沙星、環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為58.6%、55.2%和51.7%。16株耐藥株全部發生gyrA基因S83突變，9株發生parC基因的S80突變，MICs范圍16～≥128mg/L，7株未發生parC基因的S80突變，MICs范圍4～32mg/L。結論gyrA和parC基因突變在淋肺炎克雷伯菌對喹諾酮類藥物耐藥中起重要作用，parC基因S80位突變與耐藥程度密切相關。

肺炎克雷伯菌；gyrA和parC基因/突變；耐藥

Abstract：[Objective] To analyze the relationship between the mutations in the quinolone-resistance-determining-region (QRDR)of gyrA and parC genes and the quinolone resistance in K. pneumoniae isolates. [Method] The MICs of 3 quinolone-drugs were determined. PCR and DNA sequencing were conducted to analyze QRDR associated genes of gyrA and parC in 26 isolates. [Result]The resistance rate of the 87 isolates were 58.6%, 55.2% and 51.7% to norfloxacin, ciprofloxacin and levofloxacm, respectively. In gyrA gene, all 16 resistant isolates had mutation of S83. 9 of 16 resistant isolates had mutation of S80 with MICs ranging from 16 to ≥128mg/L. 7 of 16 resistant isolates were not found mutation of S80 with MICs ranging from 4 to 32. [Conclusion] Mutations in gyrA and parC genes play an important role in the development of quinolone resistance in K. pneumoniae. Mutation of S80 in parC gene are closely associated with high quinolone-resistance.

Keywords:K. pneumoniae; gyrA and parC genes/Mutation; drug resistance

臨床上一度將喹諾酮類藥物作為對肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)引起的感染性疾病的主要藥物。然而，喹諾酮耐藥肺炎克雷伯菌的出現已越來越普遍[1-2]。肺炎克雷伯菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制復雜，目前認為編碼DNA螺旋酶A亞單位gyrA基因及拓撲異構酶ⅣC亞單位parC基因的喹諾酮耐藥決定區(QRDR)突變起了重要作用且存在地域差異[3-4]。為了解本地區肺炎克雷伯菌臨床菌株喹諾酮類藥物耐藥機制，我們收集了87株臨床菌株并檢測其對3種喹諾酮藥物的耐藥性，PCR擴增26株臨床菌株gyrA和parC基因并直接測序，探討gyrA和parC基因的QRDR突變與耐藥的相關性。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

87株肺炎克雷伯菌臨床菌株2010年1月至2012年6月由本院采集檢驗科分離，肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC10031和PCR陰性對照大腸埃希菌標準株ATCC25922均購自中國藥品生物制品檢定所。用普通肉湯瓊脂(Oxoid)37℃培養細菌。

1.2 藥敏試驗

瓊脂稀釋法測定87株臨床菌株和標準菌株ATCC10031對諾氟沙星、環丙沙星和左氧氟沙星的最低抑菌濃度(MIC)[2]。判斷標準參考2010年CLSI制定的抗菌藥物敏感性標準。

1.3 PCR及測序

以大腸埃希菌標準株和肺炎克雷伯菌標準菌株為陰性對照和陽性對照，各細菌株培養物沉淀中加入25μL 細菌裂解液，充分混勻后沸水浴10 min，10000 rpm離心取2μL上清作為PCR的DNA模板。參考文獻[3]設計擴增肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因片段引物。 委托上海Invitrogen公司測序合成引物。PCR參數：94℃ 4min；94℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 30s，35個循環；72℃ 5min。采用PCR純化試劑盒提純化PCR產物，委托Invitrogen公司測序。參照已報道的肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因序列進行比較，以確定上述菌株gyrA和parC基因突變情況。

1.4 統計學處理

實驗數據采用χ2檢驗，對檢測結果進行比較，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏結果

87株克雷伯菌臨床菌株對諾氟沙星、環丙沙星和左氧氟沙星耐藥率分別為58.6%(51/87)、55.2%(48/87)和51.7%(45/87)。

2.2 PCR擴增結果

1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示26株肺炎克雷伯菌和標準ATCC10031菌株在441和389bp位置均有gyrA和parC基因擴增的目的片段。同樣條件下陰性對照大腸埃希菌標準株PCR擴增結果為陰性，此處不顯示。

2.3 PCR產物測序結果

ATCC10031標準菌株gyrA基因83位和87位分別為絲氨酸(S)和天冬氨酸(D)，parC基因80位為S。10株敏感株MICs≤0.5mg/L，gyrA基因分別有2株和3株發生S83和D87突變。16株耐藥株gyrA基因全部發生S83突變，類型有S83F/I/Y/K，11株發生D87E/A突變。敏感株不存在S80突變，耐藥株中9株存在S80I/B突變。9株存在S80突變菌株除1株諾氟沙星和環丙沙星的MIC=16mg/L外其余8株對3種諾酮類藥物的MICs ≥32mg/ L，7株不存在S80突變菌株，除2株對諾氟沙星的MIC =32mg/L其余耐藥菌MICs≤16mg/L。 見表1。

表1 26株肺炎克雷伯菌臨床菌株對3種喹諾酮類藥物的MICs及gyrA和parC突變情況

注：S、D、Y、A、E、F、I、K和B分別代表絲氨酸、酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和精氨酸

3 討論

肺炎克雷伯菌是各醫院感染中最常見的病原菌之一，可引起肺部、尿路、血液系統等多部位感染，細菌耐藥性已經成為抗感染失敗的重要因素[2-4]。我們研究了87株臨床菌株對3種對喹諾酮類藥物耐藥情況，結果耐藥率分別為58.6%、55.2%和51.7%，其耐藥率與黑龍江徐艷[5]、浙江上虞卜勁松[1]等報道相似，低于安徽郜玉峰等[6]報道，高于浙江義烏陳如昌等[7]報道。提示肺炎克雷伯菌對喹諾酮類藥物耐藥率較高且存在地區性差異。

文獻報道gyrA和parC基因QRDR突變可使各種喹諾酮類藥物MIC增加4～8000倍不等[4]。我們的藥敏結果10株敏感株對3種藥物的MICs≤0.5 mg/L，而同時存在S83、D87和S80突變的菌株MICs ≥128mg/L。26株臨床菌株gyrA和parC基因測序結果顯示，耐藥株與敏感株gyrA基因S83突變發生率差異有統計學意義(χ2=18.5，P<0.05)，提示肺炎克雷伯菌gyrA基因S83突變發生與喹諾酮類藥物耐藥密切相關。所有敏感株都不存在parC基因S80突變，耐藥株中9株存在S80I或S80B突變，耐藥株與敏感株parC基因S80突變發生率差異有統計學意義(χ2=8.6，P<0.05)，提示肺炎克雷伯菌parC基因S80突變發生與喹諾酮類藥物耐藥密切相關；9株存在S80突變耐藥株除1株諾氟沙星和環丙沙星的MIC=16mg/L外，其余8株對3種諾酮類藥物的MICs ≥32mg/L，而不存在S80突變的耐藥株除2株對諾氟沙星的MIC =32mg/L 外其余耐藥菌株MICs≤16mg/ L，提示耐藥菌株S80突變可提高肺炎克雷伯菌對喹諾酮類藥物耐藥程度，這與國外文獻報道相似[4]。

[1]卜勁松.201株肺炎克雷伯菌耐藥性分析及其gyrA基因分析[J]. 中華醫院感染學雜志，2012,22(1)：9-11.

[2]Nesar S, Shoaib MH, Rahim N, et al. Emergence of resistance to fluoroquinolones among gram positive and gram negative clinical isolates. Pak J Pharm Sci. 2012, 25(4):877-881.

[3]Kumar V, Sun P, Vamathevan J, et al. Comparative genomics of Klebsiella pneumoniae strains with different antibiotic resistance profiles. Antimicrob Agents Chemother. 2011, 55(9):4267-4276.

[4]Chen FJ, Lauderdale TL, Ho M et al. The roles of mutations in gyrA, parC, and ompK35 in fluoroquinolone resistance in Klebsiella pneumoniae. Microb Drug Resist. 2003, 9(3):265-271.

[5]徐艷，付英梅，張文莉，等. 肺炎克雷伯菌gyrA基因與parC基因的突變研究[J]. 中國微生態學雜志，2008,20(4)：350-352.

[6]郜玉峰，李家斌.2006-2007年安徽省大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌耐藥性監測研究[J]. 中華醫院感染學雜志，2009,19(12)：1586-1589.

[7]陳如昌，王利健.2006—2009年重癥監護病房醫院感染大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌的耐藥性分析[J]. 中華醫院感染學雜志，2011,21(5)：1013-1015.

TherelationshipbetweengyrAandparCgenemutationsofKlebsiellapneumoniaeandquinoloneresistance

ZhangYouchun1 ，WANGZhiping2@

(1. Maternal and Child Health Hospital of Chunan, Zhejiang 311700,China； 2. Zhejiang Medical College， Huangzhou310053,China)

張友春(1970-)，男，浙江淳安人，本科，主管技師。研究方向：臨床醫學檢驗

王志平 hzdwzp99@163.com

R378

A

1672-0024(2013)03-0048-03

*