黃芪提取物抑制胃癌細胞對腹膜間皮細胞損傷的實驗研究

那 迪，姜成鋼，徐 昊，徐 巖，王振寧，徐惠綿

腹膜轉移是影響胃癌手術預后的重要原因之一，是否轉移直接關系術后生存率［1］。腹膜轉移會顯著加劇胃癌晚期的進程及惡化程度，然而轉移的機制仍不十分明晰。腹膜為癌細胞轉移提供了所需的炎性介質，在癌腹膜轉移早期，由癌細胞、成纖維細胞、間皮細胞等分泌的細胞因子作用于間皮細胞，使間皮細胞在形態結構功能上發生改變，為腹膜轉移提供“土壤”［2］。間皮細胞通過抵御腫瘤釋放的因子來阻止腫瘤細胞浸潤［3］。在對癌細胞浸潤間皮細胞的研究中，Buck等把Walker 256癌細胞接種到間皮細胞受損的小鼠腹腔內后，觀察到癌細胞在受損區域迅速種植生長，而間皮細胞完好的小鼠卻很少發生轉移［4］。推測胃癌細胞可以破壞腹膜間皮細胞，從而形成腹膜轉移，而黃芪具有抗腫瘤作用［5］，可間接保護腹膜間皮細胞。基于上述假設，筆者擬建立胃癌細胞對腹膜間皮細胞的損傷模型，并檢測黃芪對腹膜間皮的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 試劑:黃芪提取液購自正大青春寶公司;MTT、33258染料購自Sigma公司;FCS、DMEM、PI均購自Biosharp公司。細胞系:人胃癌細胞株MKN45由中國醫科大學細胞生物教研室提供。人腹膜間皮細胞系由中南大學湘雅二院彭佑銘教授饋贈(細胞株由法國巴黎TENON醫院Pierre RONCO教授建立)。

1.2 方法

1.2.1 光鏡下人腹膜間皮細胞形態學變化 人腹膜間皮細胞系用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養液，在37℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養，至生長到對數期分3組:對照組為只加DMEM培養液的間皮細胞;實驗組1為間皮細胞加胃癌MKN45細胞上清;實驗組2為間皮細胞加胃癌MKN45細胞上清與黃芪提取液共培養。光鏡下觀察作用24 h后腹膜間皮細胞形態學變化。

1.2.2 MTT檢測黃芪作用后人腹膜間皮細胞生長曲線 分組同上。分別于共培養12、24、48 h后加入MTT，繼續培養4 h，吸除孔內液體，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩 10 min，酶標儀檢測 490 nm波長處各孔的吸收度，檢測間皮細胞存活率，并繪制生長曲線。存活率=實驗組光吸收值/對照組光吸收值×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 分組同上，培養24、48 h后用0.25%胰蛋白酶適度消化細胞，離心，分別制備各組單細胞懸液。移入新的1.5 mL離心管中，4℃ 500×g，離心5 min，形成細胞團。小心移去上清液，冰預冷PBS洗細胞2次，保證每管細胞數至少106個細胞，上機檢測，檢測細胞凋亡率。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察間皮細胞凋亡情況 將蓋玻片置于6孔板底，間皮細胞(1×106/孔)接種過夜，分組同上。黃芪提取液濃度為100 μg/mL，作用24 h，PBS洗2次，加入固定液(甲醇與冰乙酸的體積比為3∶1)固定15 min，PBS洗2次，加Hoechst 33258熒光染料(0.5 mL)，37℃避光孵育20 min，熒光顯微鏡下觀察，照相。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17.0統計學軟件，應用Student's t-檢驗進行統計分析，結果以表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下腹膜間皮細胞形態學改變 對照組間皮細胞呈多邊形，排列完整，連續單層鋪路石樣特征(圖1A)。而接觸胃癌上清后的間皮細胞變小，形狀不規則，細胞連接松散，有的區域細胞大面積脫落形成暴露區(圖1B)。胃癌上清與黃芪提取液共培養組可見細胞數目較單純胃癌上清組增多，較致密，偶見細胞脫落，未見大面積裸露區(圖1C)。

圖1 光鏡下腹膜間皮細胞形態學改變

2.2 MTT檢測黃芪對人腹膜間皮細胞保護作用實驗組1與實驗組2于24、48 h間皮細胞存活率分別為47.32%、19.81%，67.25%、34.11%。各組間比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖2。

圖2 不同時間點胃癌上清單獨或聯合黃芪作用下間皮細胞存活率比較

2.3 流式細胞儀檢測黃芪提取液培養的間皮細胞對胃癌細胞上清的抵御作用 對照組與實驗組1、實驗組2在24、48 h凋亡率分別為12.45% ±7.42%、24.96% ±9.17%，54.10% ±14.19%、82.70% ±31.22%，38.20% ±4.23%、52.20% ±7.54%。兩組在各時間點的凋亡率比較差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 不同時間點胃癌上清單獨或聯合黃芪提取液作用下間皮細胞凋亡率比較(%)

2.4 Hoechst 33258熒光染色觀察間皮細胞凋亡在胃癌上清作用24 h后間皮細胞發生明顯改變，間皮細胞大量脫落，可見核溶解、碎裂、核固縮等凋亡特征(圖3A)。黃芪提取液與胃癌上清共同作用24 h后，比胃癌上清單獨作用組凋亡的細胞量明顯減少，間皮細胞排列規則，偶見凋亡特征(圖3B)。

圖3 Hoechst 33258熒光染色觀察間皮細胞凋亡變化(熒光顯微鏡×200)

3 討論

研究表明，胃癌細胞可以通過對間皮細胞的破壞來達到腹膜轉移的目的，Paget提出了“種子-土壤”學說，即腹膜成為胃癌細胞種植適宜的“土壤”［6-7］。本實驗通過光鏡觀察發現，胃癌細胞上清作用間皮細胞后，間皮細胞體積變小，形態不規則，細胞連接松散，甚至出現大面積脫落。MTT檢測發現，胃癌上清作用后，間皮細胞存活率顯著下降，說明胃癌細胞具有抑制間皮細胞生長、促進其凋亡作用。流式細胞儀檢測繼而發現，細胞凋亡率在胃癌上清作用前后差異有統計學意義(P＜0.01)，說明間皮細胞凋亡在胃癌腹膜轉移中廣泛存在。Hoechst 33258熒光染色從形態學顯示，胃癌上清作用后間皮細胞出現典型凋亡特征，如核固縮、核溶解、核碎裂，甚至細胞大片缺失，出現“真空區”。

黃芪有對抗毒素B1誘發癌變的作用，可增加環磷酰胺CTX抗癌活性，并促進因CTX所致機體造血功能損傷的恢復。黃芪總黃酮TFA可降解細胞脂質過氧化物生成，阻斷自由基的鏈式反應，防止細胞損傷和致突變，從而發揮抗癌作用。王曉瑜等［8］報道，黃芪提取液可通過調節花生四烯酸系統的代謝而誘導腫瘤細胞周期停滯，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，防御腫瘤侵襲和轉移，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等機制發揮其抗腫瘤作用。基于以上理論，本研究將黃芪提取液與胃癌上清共培養，作用于間皮細胞，觀察其通過抑制胃癌細胞作用而對間皮細胞的保護作用。

光鏡觀察到黃芪提取物與胃癌細胞上清共同作用間皮細胞后，間皮細胞體積比正常間皮細胞稍變小，形態規則，細胞連接比較緊密，少量細胞缺失，但未出現大面積脫落區，比胃癌上清作用組改善明顯。MTT實驗中，胃癌上清組與間皮細胞組存活率比較差異有統計學意義(P＜0.05)，說明黃芪可抑制胃癌細胞對間皮細胞的破壞，起到保護作用。流式細胞檢測中，胃癌上清組及共培養組24、48 h凋亡率比較差異有統計學意義(P＜0.05)。說明黃芪可保護間皮細胞呈時間依賴性。共培養組未出現特征性凋亡改變，只是細胞數較正常組稍減少，但未見裸露區，從形態學直觀說明黃芪具有抑制腫瘤的促凋亡作用，為臨床用藥提供依據。本研究首次證明黃芪能夠保護腹膜間皮細胞，間接證明其具有抑制胃癌細胞的促凋亡作用，在未來胃癌腹膜轉移的治療與預防中應用前景廣闊，其作用機制尚待進一步研究。

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