高麗參治療睪丸缺血再灌注損傷的實驗研究

韋思明，顏志中，周 劍

(1. 浙江醫學高等專科學校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市紅十字會醫院，浙江 杭州 310003；3. 浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江 杭州 310006)

·基礎與臨床研究·

高麗參治療睪丸缺血再灌注損傷的實驗研究

韋思明1，顏志中2，周 劍3

(1. 浙江醫學高等專科學校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市紅十字會醫院，浙江 杭州 310003；
3. 浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江 杭州 310006)

目的：睪丸扭轉復位后的損傷是一個缺血再灌注損傷。本研究探討高麗參治療睪丸缺血再灌注損傷的功效。方法60只成年雄性SD大鼠被隨機分為3組。對照組接受了左側睪丸假手術。扭轉復位組經受了左側睪丸扭轉，2小時后復位。治療組接受了同扭轉復位組一樣的外科手術，但給予高麗參口服治療。復位后4小時或3個月，行左側睪丸切除術，分析睪丸中丙二醛水平(活性氧標志)、環磷酸腺苷反應元件調控因子(cAMP-responsive element modulator, CREM)的表達和睪丸生精功能。結果睪丸扭轉復位引起睪丸丙二醛水平顯著升高，CREM表達和生精功能明顯降低。高麗參治療顯著降低了睪丸丙二醛水平，明顯提高了CREM表達和生精功能。結論高麗參對睪丸缺血再灌注損傷具有明顯的保護效應。該效應可能與減少活性氧產生、提高CREM表達有關。

高麗參;睪丸扭轉復位;缺血再灌注損傷

Abstract:[Objective] The damage after testicular torsion-detorsion (TTD) is an ischemia-reperfusion injury. This study investigated the effect of Korean ginseng (KG) on testicular ischemia-reperfusion injury. [Method] 60 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups. Control group received a sham operation of left testis. TTD group underwent 2 hours of left testicular torsion. Treatment group underwent same surgical procedure as TTD group, but KG was given orally. Left orchiectomy was performed 4 hours or 3 months after detorsion to measure malondialdehyde(a mark of reactive oxygen species), cAMP-responsive element modulator (CREM) expression and spermatogenic function. [Result] TTD caused a significant increase in malondialdehyde level and significant decreases in CREM expression and spermatogenic function. The rats treated with KG had a significant decrease in malondialdehyde level and significant increases in CREM expression and spermatogenic function. [Conclusion] KG protects testes from ischemia-reperfusion injury. The protective effect of KG may be related to decrease of reactive oxygen species production, and improvement of CREM expression.

Keywords: Korean ginseng; testicular torsion-detorsion; ischemia-reperfusion injury

睪丸扭轉又稱精索扭轉，它是泌尿外科急癥，是指精索沿其縱軸旋轉，精索內血液循環產生障礙，導致睪丸缺血甚至壞死。在25歲以下的男性發生率為1/4000，因此本病并非少見[1]。通過手術復位是治療睪丸扭轉的現有方法，可以避免睪丸因缺血而壞死。睪丸復位后即使存活，但患者隨后出現了睪丸萎縮，生精功能損傷[1]。睪丸扭轉復位后的損傷是一個典型的缺血再灌注損傷，目前缺乏相應的臨床輔助治療，所以手術后的臨床輔助治療已成為研究的重要方向之一。本研究通過建立大鼠睪丸扭轉復位模型，探討高麗參在睪丸缺血再灌注損傷中的保護作用，為更好地進行臨床治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性SD大鼠(250～300g)購于上海實驗動物中心。高麗紅參購自杭州華東大藥房連鎖有限公司。丙二醛測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。兔抗鼠環磷酸腺苷反應元件調控因子(cAMP-responsive element modulator, CREM)抗體和化學發光檢測試劑由Santa Cruz公司生產。帶辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。內參β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自Sigma公司。

1.2 高麗參溶液的制備[2]

300g高麗參在6升沸水中煮2小時，過濾，取濾液凍干。凍干粉76.6克，得率26%，4℃保存。每次實驗前，將干粉溶解在去離子的蒸餾水中作為高麗參溶液。

1.3 大鼠睪丸扭轉復位模型的制作及其治療

60只成年雄性SD大鼠隨機分為3組，每組20只。將氯胺酮以每公斤體重50mg的劑量注入大鼠腹腔麻醉。對照組大鼠：通過左側髂腹股溝切口取出左側睪丸，用11/0無創傷縫線穿過睪丸白膜。然后，睪丸通過原切口放入陰囊，切口縫合關閉。扭轉復位組大鼠：通過同樣的切口暴露左側睪丸，將左側睪丸繞精索逆時針扭轉720°，睪丸白膜與陰囊肉膜之間用11/0無創傷縫線縫合固定，防止睪丸自發復位，縫合切口。2h后，再次打開切口，將睪丸反方向旋轉復位，睪丸恢復血供，仍然存活，放睪丸入陰囊，關閉切口。治療組大鼠：也行同樣的左側睪丸扭轉復位術，但在復位的時候將溶解在水里的高麗參以每公斤體重1.0g的劑量灌胃[2]。復位后4h，每組半數的大鼠被處死，行左側睪丸切除術，測定睪丸中丙二醛水平。在治療組，剩下的大鼠繼續給予高麗參(1.0 g/kg/d)灌胃，連續3個月。復位后3個月，每組剩余的大鼠行左側睪丸切除術，分析睪丸中CREM蛋白表達和睪丸生精功能。

1.4 丙二醛水平的測定

用硫代巴比妥酸法測定睪丸中丙二醛水平, 操作步驟按照試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)說明書進行。

1.5 Western blot檢測睪丸中CREM蛋白表達

睪丸組織在裂解緩沖液中被攪拌成組織勻漿， 4℃離心15min，取上清液，用Bradford法檢測蛋白濃度。樣品(含20μg蛋白)在100℃加熱3min使蛋白變性，然后上樣，在10%SDS-PAGE膠上電泳，轉膜，37℃封閉1h，加入兔抗鼠CREM抗體，4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體，常溫孵育1h，ECL顯示膜上蛋白條帶。用GS-700型圖像密度測量儀及其分析軟件(Bio-Rad Laboratories公司產品)測定條帶密度。CREM條帶與內參照β-actin條帶的密度比值代表CREM蛋白的相對表達水平。

1.6 睪丸生精功能的分析

通過測定睪丸的重量和每日精子產量來分析睪丸生精功能。左側睪丸切除后立即稱重，在50ml含有0.154M氯化鈉、0.5%聚乙二醇辛基苯基醚、2%疊氮鈉、伊紅溶液中攪拌成勻漿。用血細胞計數板測定濃縮的精子細胞核數目，結果作為每日精子產量。

1.7 統計學處理

采用GraphPad Prism 4.0軟件處理數據。實驗數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析和q檢驗，以P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 睪丸丙二醛水平

表1顯示：扭轉復位組的丙二醛水平明顯高于對照組(P<0.05)；治療組的丙二醛水平明顯低于扭轉復位組，但仍高于對照組(P<0.05)。

表1 各組睪丸中丙二醛、CREM蛋白、睪丸重量和每日精子產量的檢測結果

注： ▲：與對照組比較P< 0.05; ◆：與扭轉復位組、對照組比較P< 0.05

2.2 睪丸中CREM蛋白的表達

表1和圖1顯示：扭轉復位組的CREM表達明顯低于對照組(P<0.05)；治療組的CREM表達明顯高于扭轉復位組，但仍低于對照組(P<0.05)。

圖1 Western blot檢測各睪丸中CREM蛋白的表達

2.3 睪丸的生精功能

表1顯示：扭轉復位組睪丸重量和每日精子產量明顯低于對照組(P<0.05)；治療組睪丸重量和每日精子產量明顯高于扭轉復位組，但仍低于對照組(P<0.05)。

3 討論

睪丸扭轉是一個常見的泌尿科急診。如果睪丸扭轉在6小時內不治療，睪丸將發生梗死[1]。但是，即使睪丸扭轉患者在這個時間內接受了外科復位手術，睪丸也將喪失正常的生精功能[1]。在我們的動物實驗中，大鼠經受了2小時的睪丸扭轉，復位后睪丸仍然存活，但睪丸生精功能嚴重受損，包括睪丸重量和每日精子產量顯著下降。然而，睪丸損傷的機制尚不清楚。

環磷酸腺苷反應元件調控因子(cAMP responsive elemental modulator , CREM)是屬于堿性域/亮氨酸拉鏈轉錄因子類，它在大多數組織中都低水平表達，而在成年男性睪丸組織中其表達水平是其它組織的一百倍,它是控制雄性生殖細胞分化和凋亡的總開關[1]。突變小鼠CREM基因使蛋白表達減少或缺失，導致小鼠睪丸重量減輕20%～25%，精液中精子數量減少46%[3]。CREM的表達對精子發育成熟必不可少。在我們的研究中，睪丸扭轉復位引起睪丸CREM表達明顯減少，睪丸生精功能也嚴重受損，包括睪丸重量和每日精子產量明顯下降。由于CREM表達對精子發育成熟必不可少，所以我們推測：CREM表達的降低可能是導致睪丸生精功能損傷的原因。高麗參的主要成分是人參皂苷，它擁有廣泛的藥理作用，如抗氧化，抗衰老，抗應激，等[4]。因此，高麗參在亞洲已經被應用幾千年治療各種疾病，如冠心病，高血壓，糖尿病，腫瘤，等。據Park等人報道，高麗參通過增加CREM表達來提高睪丸生精功能[2]。因此，我們嘗試用高麗參治療睪丸扭轉復位所誘導的損傷。結果顯示：相比于扭轉復位組，治療組睪丸CREM表達明顯升高，睪丸生精功能亦顯著提高。這表明高麗參通過提高CREM表達來減輕睪丸的損傷。在治療過程中我們沒有發現明顯的副作用，說明高麗參治療是安全的。但是，高麗參提高CREM表達的機制仍然未知。

睪丸扭轉復位是一個典型的缺血再灌注過程，在這一過程中產生了大量活性氧，如超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基。缺血組織細胞內的次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應是活性氧產生的一個重要途徑[5]。因為活性氧半衰期很短，很難直接測定，通常用活性氧引起細胞脂質過氧化產物丙二醛來間接表示活性氧水平[6]。我們的研究顯示：扭轉復位組睪丸的丙二醛水平明顯高于對照組，這提示睪丸扭轉復位后活性氧大量產生。活性氧可以通過改變基因表達來引起細胞的損傷[1]。因此，我們推測：睪丸扭轉復位后，活性氧的大量產生可能是引起CREM表達降低的原因。據報道，高麗參可以通過抑制黃嘌呤氧化酶活性來減少活性氧產生[7]。在我們的研究中，高麗參治療顯著降低了活性氧含量，明顯提高了CREM表達。這結果證實了活性氧是引起CREM表達降低的原因，也意味著：高麗參通過減少活性氧的產生來提高CREM表達。結合前面的結論：高麗參通過提高CREM表達來減輕睪丸的損傷，我們認為，高麗參通過減少活性氧的產生來提高CREM表達，從而保護睪丸的生精功能。

我們使用的高麗參劑量(1.0 g/kg/d)參考了Park等人的報道[2]，與扭轉復位組相比，治療組的這個劑量顯著降低了丙二醛水平，提高了CREM表達和生精功能，但治療后丙二醛水平、CREM表達和生精功能仍然沒有恢復到正常水平，這可能與藥物劑量有關，需要進一步研究來確定最佳治療劑量。

總之，我們證實了高麗參對睪丸缺血再灌注損傷具有明顯保護作用，并對其作用機制進行了探討，這將為臨床治療提供了一定的實驗依據。

[1]Wei SM, Yan ZZ, Zhou J. Role of cAMP-responsive element modulator-tau (CREMtau) in ipsilateral testicular injury after unilateral testicular torsion-detorsion [J]. Fertil Steril, 2008, 89(6):1737-1742.

[2]Park WS, Shin DY, Kim do R, et al.

Korean ginseng induces spermatogenesis in rats through the activation of cAMP-responsive element modulator (CREM) [J]. Fertil Steril，2007，88(4):1000-1002.

[3]Nantel F, Monaco L, Foulkes NS, et al. Spermiogenesis deficiency and germ-cell apoptosis in CREM-mutant mice [J]. Nature, 1996, 380(6570):159-162.

[4]Kim CS, Park JB, Kim KJ, et al. Effect of Korea red ginseng on cerebral blood flow and superoxide production [J].Acta Pharmacol Sin, 2002,23(12):1152-1156.

[5]金惠銘.病理生理學[M].第四版.北京：人民衛生出版社，2000.147-148.

[6]王迪潯.病理生理學[M].北京：人民衛生出版社，1994.366-381.

[7]Wei X, Su F, Su X, et al. Stereospecific antioxidant effects of ginsenoside Rg3 on oxidative stress induced by cyclophosphamide in mice [J]. Fitoterapia, 2012,83(4):636-640.

Experimentalstudyoftesticularischemia-reperfusioninjurytreatedwithKoreanginseng

WEISiming1,YANZhizhong2,ZHOUJian3

(1. Zhejiang Medical College, Hangzhou310053,China；2. Red Cross Hospital of Hangzhou City, Hangzhou 310003, China；3. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China)

韋思明(1971-)，男，浙江杭州人，博士，副教授。研究方向：泌尿外科學

浙江醫學高等專科學校博士科研啟動基金資助項目(編號:2008B05)

R697.22

A

1672-0024(2013)02-0035-04

作者簡介：張 焱(1973-)，女，浙江金華人，本科，副主任護師 。研究方向：老年護理