采用組織芯片研究非小細(xì)胞肺癌中腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1、血管內(nèi)皮生長因子C的表達(dá)及意義

孫向東 王曉萍 汪 棟

1.解放軍第八一醫(yī)院全軍腫瘤中心腫瘤放射治療科，江蘇南京 210000；2.解放軍第八一醫(yī)院全軍腫瘤中心心胸外科，江蘇南京 210000

肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤的重要生物學(xué)行為特征，也是患者死亡的最主要原因。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是非小細(xì)胞肺癌重要的轉(zhuǎn)移途徑，血管內(nèi)皮生因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）是特異性的新生淋巴管刺激因子，能夠促進(jìn)毛細(xì)淋巴管的新生并增加淋巴管內(nèi)皮的通透性，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移更易發(fā)生[2]。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（metastasis-associated gene 1，MTA1） 是 MTA（metastasisas sociated）家族成員之一，被認(rèn)為是核小體重構(gòu)及組蛋白脫乙酰基酶復(fù)合物的組成部分，其表達(dá)的增高與多種上皮性惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)對MTA1和VEGF-C的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)合臨床、病理資料，分析它們與臨床因素之間的相關(guān)性，探討它們與非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集解放軍第八一醫(yī)院全軍腫瘤中心2008年1月～2010年3月的186例肺癌切除手術(shù)標(biāo)本。男137例，女49例，年齡31～75歲，中位年齡55歲。肺鱗癌105例，其中低分化42例，中分化37例，高分化26例。肺腺癌81例，其中低分化35例，中分化32例，高分化14例。TNM分期：Ⅰ期40例，Ⅱ期72例，Ⅲ期61例，Ⅳ期13例。同時(shí)收集23例距腫瘤邊緣＞5 cm處的正常肺組織為對照。

1.2 試劑

羊抗人MTA1多克隆抗體和VEGF-C多克隆抗體均購自Santa Cruz公司，即用型免疫組化超敏S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物試劑開發(fā)公司。檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液、PBS緩沖液、蘇木素染色劑、中性樹膠封片劑、多聚賴氨酸、石蠟、各種濃度乙醇、甲醛等，均來自解放軍第八一醫(yī)院病全軍腫瘤中心的病理科。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片制作 從病理科的存檔中選取各型非小細(xì)胞肺癌蠟塊，同時(shí)調(diào)閱相應(yīng)的HE染色組織切片及患者的病歷資料，同時(shí)新近收集肺癌及正常肺組織制備組織蠟塊。將所有非小細(xì)胞肺癌組織蠟塊分類登記，按文獻(xiàn)要求進(jìn)行設(shè)計(jì)[4]。對每一組織標(biāo)本，均先觀察蘇木精-伊紅切片以確定腫瘤部位，每一例肺癌蠟塊選取4點(diǎn)、正常組織蠟塊選取2點(diǎn)，共制成20×12陣列塊。

1.3.2 免疫組化方法 采用S-P方法，檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)。在染色中，各種抗體染2張TMA的連續(xù)切片。另外還選擇了10例相應(yīng)非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本，作常規(guī)HE切片染色來驗(yàn)證組織代表性。陰性對照以PBS代替一抗。陽性對照以相應(yīng)抗體的已知陽性切片作對照。結(jié)果判定：以非小細(xì)胞肺癌胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒，定位較明確、染色明顯的切片視為表達(dá)陽性。表達(dá)強(qiáng)度的分析，筆者采用每個(gè)切片選取5個(gè)視野，Image-Pro Plus（Media Cybe Netics Inc，USA）圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，測算單位面積平均光密度（OD）值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 12.0處理。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTA1蛋白的表達(dá)

MTA1蛋白表達(dá)定位于非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞核，呈明顯的棕黃色顆粒狀。23例正常肺組織中均無陽性表達(dá)。在186例非小細(xì)胞肺癌中，共有陽性染色103例（陽性率為62.8%）；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的117例非小細(xì)胞肺癌中，MTA1表達(dá)陽性的共有83例（陽性率為70.9%），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的69例非小細(xì)胞肺癌中，MTA1表達(dá)陽性的共20例（陽性率為29.0%）。MTA1蛋白的表達(dá)與腫瘤病理學(xué)各參數(shù)間的關(guān)系見表l。MTA1蛋白陽性表達(dá)在年齡、性別、病理組織類型方面無差異，但是在非小細(xì)胞肺癌的TNM分期、分化程度以及淋巴轉(zhuǎn)移情況等方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見圖1、表1。

2.2 VEGF-C的表達(dá)

VEGF-C蛋白陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞漿。在186例中有119例染色陽性（64.0%），23例正常肺組織中4例陽性表達(dá)（17.4%），兩者比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的117例非小細(xì)胞肺癌中，VEGF-C陽性者共98例（陽性率為83.8%），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的69例非小細(xì)胞肺癌中，VEGF-C陽性表達(dá)共21例（陽性率為30.4%）。VEGF-C蛋白的陽性表達(dá)與腫瘤病理學(xué)各種參數(shù)間的關(guān)系參見表l。VEGF-C蛋白的陽性表達(dá)在年齡、性別、病理類型、分化程度方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是在非小細(xì)胞肺癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表1。

2.3 MTA1蛋白和VEGF-C蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)性

對MTA1、VEGF-C蛋白表達(dá)OD值進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明兩者有相關(guān)性（r=0.175，P＜0.01）。

表1 MTA1和VEGF-C在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)[n（%）]

3 討論

肺癌的五年生存率僅為16%[5]，而非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌的80%。影響生存的主要原因是肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)是一個(gè)重要的預(yù)后因素，由于肺內(nèi)淋巴系統(tǒng)發(fā)達(dá)，極易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，闡明肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有著重要的臨床意義。

VEGF-C是被公認(rèn)的促淋巴管生成因子，主要通過其受體VEGFR-2和VEGFR-3發(fā)揮作用，可促進(jìn)腫瘤微淋巴管生成及腫瘤細(xì)胞向區(qū)域淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，并且能夠通過淋巴系統(tǒng)向全身各處進(jìn)行廣泛的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散[6]。Weryńska等[7]研究表明，腫瘤細(xì)胞能夠促進(jìn)淋巴管生成的調(diào)控因子VEGF-C的表達(dá)，從而誘導(dǎo)淋巴管新生，被誘導(dǎo)生成的淋巴管進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀況。VEGF-C還可以促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞密集區(qū)內(nèi)的大量生成，同時(shí)可以導(dǎo)致淋巴管明顯擴(kuò)張，由于新生微淋巴管的結(jié)構(gòu)尚沒有發(fā)育完善，依然是高滲漏的狀態(tài)，從而利于腫瘤細(xì)胞滲漏入淋巴管，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的發(fā)生[8]。

筆者研究顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中VEGF-C的陽性表達(dá)率為64.0%，正常組織為17.4%。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示VEGF-C在NSCLC的發(fā)生中起重要作用。VEGF-C在性別、年齡、病理組織類型、分化程度方面無差異；VEGF-C蛋白的陽性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著相關(guān)性（P＜0.01），說明VEGF-C蛋白在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移中起著顯著的作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MTA1）是一個(gè)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中表達(dá)上調(diào)的基因，1993年第一次應(yīng)用差異雜交的技術(shù)，從鼠乳腺癌細(xì)胞株13762NF中分離出一種新的乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[9]。隨后，Toh等[10]應(yīng)用Southern技術(shù)，找到了其相應(yīng)的同源基因，該基因的表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，故被命名為MTA1。現(xiàn)已證實(shí)MTA1與各種腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起到相應(yīng)的作用。Yu等[11]檢測INSCLC中MTA1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果提示，該基因的表達(dá)與NSCLC的分化程度密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別和病理類型無相關(guān)性。Song等[12]應(yīng)用免疫組化方法檢測了174例食管癌中MTA1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MTA1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的過度表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測186例NSCLC患者癌組織中和23例正常肺組織中MTA1蛋白的表達(dá)情況，MTA1在非小細(xì)胞肺癌的正常肺組織未見表達(dá)。在癌組織中的陽性表達(dá)者為103例（55.4%），與正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示了MTA1基因在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了一定作用；而在不同性別、年齡及組織學(xué)類型中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，MTA1蛋白在低分化癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于中高分化組織（P＜0.05），說明MTA1蛋白表達(dá)與肺癌的分化程度密切有關(guān)，提示MTA1蛋白可能與抑制癌細(xì)胞的分化成熟有關(guān)；經(jīng)臨床病理分析發(fā)現(xiàn)，MTA1蛋白的表達(dá)水平與臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MTA1的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的惡性程度、局部的侵襲轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，MTA1高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌具有更強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

筆者進(jìn)行的研究顯示，TNM分期晚，并且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌，MTA1、VEGF-C蛋白的陽性表達(dá)明顯高于TNM分期早并且沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，尤其是兩者相關(guān)性分析提示，非小細(xì)胞肺癌中MTA1表達(dá)與VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，由此推斷，MTA1與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其促進(jìn)侵襲與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與VEGFC有關(guān)，但兩者的進(jìn)一步關(guān)系尚需實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)。

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