心肌細胞肥大中番茄紅素對自噬的作用

汪海寧 李吉林 姚懷齊 楊寶軍 徐 坦

汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣東汕頭 515041

番茄紅素（lycopene，Lyc）是一種廣泛存在于紅色水果和蔬菜中的天然生物色素，屬于類胡蘿卜素一族，因最早發(fā)現(xiàn)于番茄中而得名[1]。目前國內(nèi)外大量的研究證明Lyc不僅有極強的抗氧化能力[2]，還具有抑制炎癥因子表達、抗癌、預防衰老等多種生物學效應(yīng)[3-4]。雖然，近年來有少量關(guān)于Lyc可以防治心血管疾病、抗缺血缺氧、抑制動脈粥樣硬化等文獻報道[5-6]，但到目前為止，未見有關(guān)于其在心肌肥大方面的作用和機制的研究。因此，探索其內(nèi)在的作用機制對于尋找預防和控制高血壓等心臟肥大疾病的臨床有效治療具有重要的意義。

心肌肥大的本質(zhì)是細胞合成代謝與分解代謝的失衡，機體主宰分解代謝的途徑主要有自噬。自噬（autophagy，Atg）是廣泛存在于真核細胞中一個保守的生物學現(xiàn)象，它是通過包裹待降解物形成自噬體，然后與溶酶體結(jié)合進行多種酶的消化及降解，參與機體受損細胞器和蛋白質(zhì)的清除，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要方式[7]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3（tiny tubes related proteins 1 light chain 3，LC3）是自噬的特異性蛋白，分為胞質(zhì)型LC3-Ⅰ和膜型LC3-Ⅱ，后者是LC3的活性形式[8]。在既往的研究中[9]，筆者已經(jīng)證實在心肌肥大中自噬受到抑制，阻斷自噬會促進心肌肥大的發(fā)展，而Lyc是否對心肌肥大產(chǎn)生作用，其作用是否與自噬相關(guān)尚未明確；本研究旨在AngⅡ誘導的心肌肥大中明確Lyc的作用，探討Lyc和自噬的關(guān)系。

1 材料

1.1 動物

SD乳鼠，清潔級，1～2日齡，汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心提供（SCXK粵2012-0017）。

1.2 主要試劑

DMEM-F12培養(yǎng)基（SH30023.01B）和胎牛血清（SV30087.01）（Hyclone）；胰蛋白酶（25200056）和Ⅰ型膠原酶 （B1067）（Gibco）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷 BrdU（B5002），血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）（A9525）和 3-甲基腺嘌呤 3MA（M9281）（Sigma）；Lyclycopene（L9879-10MG）（Sigma-Aldrich）；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 LC3Ⅰ/Ⅱ抗體（3868s），Bclin1 抗體（3738s）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶 GADPH（2118s）（Cell Signaling Technology）；羊抗兔 IgG-HRP（SA00001-2）（PTG，proteintech group），免疫印跡發(fā)光液 （WBKLS0100）（Millipore）， 四氫呋喃（THF） （tetrahydrofuran） 和 2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）（butylated hydroxytoluene）（上海寶曼生物科技有限公司）；無核酶水（9012），逆轉(zhuǎn)錄酶（DR100A），RNA酶抑制劑+脫氧核糖核苷酸混合物（RR02MA）（Takara）。

2 方法

2.1 原代心肌細胞分離和培養(yǎng)

消毒乳鼠，開胸取心臟，用D-Hank's溶液去血污，分離心室。置入離心管，剪碎1 mm3大小，加入0.125%的胰酶 37℃消化10 min，棄上清，放入 0.05%Ⅰ型膠原酶，37℃振蕩消化2 h。用上述胰酶重復消化1～2次，每次約6 min。將細胞懸液集中放入含10%胎牛血清培養(yǎng)基，均勻接種到培養(yǎng)皿，放置于5%CO2的培養(yǎng)箱60 min以分離成纖維細胞。以1×106/mL密度接種于6孔板，加入100 U/mL鏈霉素和青霉素防止污染，及0.1 mmol/L的Brdu抑制成纖維細胞生長，最后放入50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。接種24 h后80%的細胞生長成片并有規(guī)律搏動時，換無血清DMEM處理24 h后分組干預。在予以Lyc處理前，先將Lyc溶解于含有 0.025%丁基羥基甲苯（BHT）的四氫呋喃。其在培養(yǎng)基中的濃度控制在0.05%（V/V），不會影響細胞活性。

2.2 細胞實驗分組

首先在 AngⅡ（1 μmol/L）誘導的心肌肥大中，觀察Lyc（5 μmol/L）對細胞的作用，將心肌細胞分為四組進行干預：對照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc 組（5 μmol/L）和Lyc組（5 μmol/L）；于 48 h檢測心肌肥大的標志物ANP的mRNA表達水平。為觀察心肌肥大時Lyc（5 μmol/L）對自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3蛋白的影響，將心肌細胞分為四組進行干預：對照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc 組（5 μmol/L）和 AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）組+3-MA（5 μmol/L）組；于 48 h 以 Western blot法測定Beclin1和LC3蛋白的水平。

2.3 細胞鏡檢

用AngⅡ和（或）Lyc干預48 h的心肌細胞以4%PFA固定，顯微鏡400倍拍照，每組取50個同樣大小視野，利用圖像分析軟件Image pro plus 6.0計算細胞面積[9]。

2.4 Western blot檢測蛋白的表達

冰上裂解細胞30 min，收取蛋白。取總蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白以80 V，100 min轉(zhuǎn)至 PVDF膜上；用 50 g/L的 BSA封閉 1 h，加 LC3B抗體（1∶1000）、GADPH 抗體（1∶10 000）4℃孵育過夜；次日用TBST洗膜，與辣根過氧化物酶標記的抗體（1∶10 000）室溫孵育 1 h；用 ECL顯影、曝光。采用圖像分析軟件檢測蛋白條帶的灰度值，LC3Ⅱ與LC3Ⅰ條帶的比值代表LC3蛋白的表達水平，其余以GAPDH作為參照[9]。

2.5 實時定量PCR

常規(guī)Trizol裂解法提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照文獻[9]做標準曲線和定量PCR體系。在Roche PCR分析儀器里擴增目的基因，反應(yīng)條件為：94℃預變性 5 min，然后 94℃ 15 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共 30 循環(huán)，72℃ 6 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用PCR儀配套軟件進行分析。重復3次，數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。引物序列：ANP：上游引物5'-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3'，下游引物5'-AGGCCAGGAAGAGGAAGAAG C-3'；GAPDH：上游引物5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物 5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，各組之間的差異用One-way ANOVA比較均值的單因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 Lyc在AngⅡ誘導心肌肥大中的作用

本研究從心肌細胞形態(tài)、細胞面積及心肌肥大標志物水平這三個方面，明確Lyc在AngⅡ誘導心肌肥大中的作用。將心肌細胞分為四組進行干預：對照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）和 Lyc（5 μmol/L）組；結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ刺激48 h后細胞面積增大（P＜0.01），心肌肥大標志物ANP的mRNA水平上調(diào)（P＜0.01）；Lyc結(jié)合 AngⅡ干預，細胞大小和面積明顯減小（P＜0.05），ANP的mRNA比值顯著下降（P＜0.05）；而用 Lyc本身對心肌細胞大小和形態(tài)無明顯作用（P＞0.05），ANP的mRNA比值無顯著影響（P ＞ 0.05）（圖1、表1）。 提示 Lyc可抑制 AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。

圖1 Lyc在AngⅡ誘導心肌肥大中的作用

表1 四組大鼠心肌細胞面積和ANPmRNA測定結(jié)果比較（±s，n=5）

表1 四組大鼠心肌細胞面積和ANPmRNA測定結(jié)果比較（±s，n=5）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與 AngⅡ組比較，#P＜0.05

組別 細胞面積（像素） ANP的相對含量對照組260.50±26.486.35±0.99 AngⅡ組517.19±52.31**17.83±2.07**AngⅡ+Lyc組355.82±40.45#12.16±1.41#Lyc組254.09±27.635.60±0.87 F值56.518157.048 P值 ＜0.05＜0.05

3.2 在心肌肥大中Lyc對自噬的作用

為明確在心肌肥大中Lyc對自噬的作用，將細胞分為四組：對照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc 組（5 μmol/L）和 AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）組+3-MA（5 μmol/L）組；于48 h以Western blot法測定Beclin1和 LC3蛋白的水平，LC3Ⅱ/Ⅰ反應(yīng)自噬活性。結(jié)果顯示：與對照組比較，AngⅡ干預 48 h后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和 Beclin1的蛋白水平下降（P＜0.05），加入 Lyc干預后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和 Beclin1的蛋白水平有所增加 （P＜0.05），而使用 3-MA后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和 Beclin1的蛋白水平迅速下降（P ＜ 0.01）；3-MA（5 μM）對細胞本身無影響（圖2、3，表2）。

圖2 在心肌肥大中Lyc對LC3蛋白的影響

圖3 在心肌肥大中Lyc對Beclin1蛋白的影響

4 討論

從20世紀末人們發(fā)現(xiàn)服用Lyc能明顯降低前列腺癌的發(fā)病率至今，已有大量的流行病學調(diào)查、臨床研究和動物實驗證明Lyc具有極強的抗氧化能力，可以預防各種慢性疾病[8-10]。特別是在心血管疾病中，Lyc不僅可以降低血脂，降低收縮壓，減少心血管疾病的風險，還能緩解缺血/再灌注損傷[11-12]。但對于其是否有抑制心肌肥大的作用及相關(guān)機制，目前國內(nèi)尚未有報道。本實驗首次在心肌肥大的模型上探討Lyc的作用和與自噬之間的關(guān)系。本實驗觀察到，AngⅡ干預心肌細胞后細胞面積明顯增大、心肌肥大標志物心房利鈉多肽（ANP）明顯上升，說明AngⅡ誘導的細胞肥大模型成功；然后加入Lyc干預發(fā)現(xiàn)，Lyc減少了AngⅡ誘導心肌細胞面積的增大，降低了ANP的升高，在一點程度上對心肌肥大起到了抑制作用。實驗進一步發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導的細胞肥大中伴有自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3蛋白表達的下降，而Lyc的干預卻促進了自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3蛋白的表達。利用自噬阻斷劑3MA降低了Lyc對心肌細胞肥大的抑制作用，提示Lyc可能通過激活自噬來抑制AngⅡ誘導的心肌肥大。

表2 四組大鼠心肌LC3和Beclin1蛋白測定結(jié)果比較（±s，n=5）

表2 四組大鼠心肌LC3和Beclin1蛋白測定結(jié)果比較（±s，n=5）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 AngⅡ組比較，#P＜0.05；與 AngⅡ+Lyc組比較，**P＜0.01

組別 LC3蛋白相對含量 Beclin1蛋白相對含量對照組0.671±0.0520.734±0.067 AngⅡ組0.408±0.041*0.451±0.053*AngⅡ+Lyc組0.608±0.045#0.685±0.058#AngⅡ+Lyc+3-MA 組0.219±0.023**0.347±0.049**F值177.114202.873 P值 ＜0.05＜0.05

自噬在心臟中的作用存在著爭議。早在20世紀80年代，人們就發(fā)現(xiàn)心肌細胞蛋白質(zhì)合成增加和細胞肥大的同時，伴隨著自噬水平的降低[13]。21世紀初Nakai等[14]在橫主動脈縮窄誘導的早期心肌肥大模型中發(fā)現(xiàn)，自噬水平明顯低于假手術(shù)組，提示心肌肥大代償期，自噬活性顯著下降；此外亦有文獻報道自噬的激活劑雷帕霉素可以阻斷由主動脈縮窄[15]、甲狀腺激素[16]引起的心肌肥大，并且逆轉(zhuǎn)已經(jīng)存在的心肌肥大[17]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3可通過上調(diào)自噬水平，使心肌肥大的心臟體積縮小[18]。目前關(guān)于Lyc對自噬的作用在心臟病中的研究是空白。筆者前期實驗表明自噬對于AngⅡ誘導的心肌肥大發(fā)展可能起抑制作用[9]。本實驗在細胞水平上明確了Lyc具有抗心肌肥大和提高自噬水平的作用，而阻斷自噬會明顯降低Lyc對細胞肥大的影響，提示自噬可能是Lyc抑制心肌肥大的一個重要環(huán)節(jié)，而Lyc是如何調(diào)控自噬，其具體分子機制仍需進一步的研究和探索。

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