他克莫司對EAE鼠血清IL-12和IFN-γ的影響及其與髓鞘堿性蛋白相關性的研究

趙麗波 張健莉 付宏娟 黃月萍

黑龍江省醫院老年神經內科，黑龍江哈爾濱 150036

多發性硬化（mulitple sclerosis，MS）是一種以中樞神經系統白質脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫性疾病，MS產生的免疫反應多認為是自身免疫細胞被激活后對髓鞘堿性蛋白（MBP）的免疫反應[1]。MBP是構成中樞神經系統髓鞘的一種特殊蛋白質，在髓鞘形成和腦分化發育過程中起著重要作用[2]。MS患者體內中樞神經系統的自身抗原-MBP暴露與免疫活性細胞相互作用誘導了特異的免疫應答，導致炎性髓鞘病理性脫失，游離的MBP就會進入血液中導致血液中含量升高[3]。目前臨床對MS進行腦脊液免疫學檢查項目較多，但尚無一滿意的特異性檢查，因此，臨床一般將周圍血和腦脊液同時進行檢查[4]。本研究旨在通過觀察利用MBP作為抗原，復制MS的動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）豚鼠周圍血和腦脊液MBP、血清白介素 12（IL-12）干擾素 γ（IFN-γ）的水平，并動態觀察應用他克莫司治療前及治療后不同時間MBP、IL-12、IFN-γ的變化情況，從而可能為預防MS臨床復發提供一種有效的新藥提供指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

大鼠 IL-12、IFN-γ、MBP（ELISA）試劑盒（美國 R&D公司）；BIO-RAD 550型酶標儀（美國BIO-RA D公司）。

1.2 實驗動物及方法

豚鼠22只，雌雄各半，7～8周齡，體重 200～250 g，利用MBP作為抗原，復制MS的動物模型EAE，在每只大鼠的雙側后足跖一次性皮下注射含有豚鼠MBP 25 μg的弗氏完全佐劑（FCA）200 μL，模型制備成功的表現為急性、嚴重的單向病程，可自發緩解。將試驗動物隨機分為研究組（12只）和對照組（10只），對照組予以 EAE+生理鹽水，研究組在EAE誘導的第1～7天，每日腹腔內注射劑量為1 mg/kg的他克莫司，其中急性發作期8只，緩解期4只。

1.3 檢測方法

大鼠心室內取血0.6 mL，靜置20 min，3 000 r/min離心 20 min，取血清-20℃凍存，備測 IL-12、IFN-γ、MBP 用。IL-12、IFN-γ、MBP 檢測采用雙抗體夾心法（ELISA）測定，操作方法嚴格按使用說明書進行。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 13.0進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用 t檢驗，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清和腦脊液中MBP水平比較

研究組大鼠血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。且兩組腦脊液中的MBP水平均顯著高于血清中MBP水平，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組血清和腦脊液中MBP水平比較（±s）

表1 兩組血清和腦脊液中MBP水平比較（±s）

注：與血清MBP比較，#P＜0.01

組別 只數 MBP水平血清（ng/mL） 腦脊液（ng/mL）研究組對照組t值P值12 10 7.62±1.74 1.52±0.83 3.946＜0.01 12.07±3.42#4.39±1.35#5.284＜0.01

2.2 大鼠急性發作期及緩解期血清及腦脊液MBP水平及血清IL-12、IFN-γ水平比較

研究組MS大鼠急性發作期及緩解期血清及腦脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平均明顯高于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01），且MS急性發作期血清及腦脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平均分別顯著高于MS緩解期，差異有高度統計學意義（P＜0.01），且MS大鼠其腦脊液 MBP和血清MBP水平呈正相關（r=0.562，P＜0.01）。見表2。

表2 MS大鼠急性發作期及緩解期血清及腦脊液MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比較（±s）

表2 MS大鼠急性發作期及緩解期血清及腦脊液MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與緩解期比較，#P＜0.01

組別 只數MBP水平血清（ng/mL）腦脊液（ng/mL）IL-12（pg/mL）IFN-γ（ng/mL）急性發作期組緩解期組對照組841 0 10.86±1.59*#5.35±1.14*1.52±0.83 17.45±2.82*#8.23±1.44*4.39±1.35 32.60±10.52*#22.50±6.42*16.63±3.13 15.65±3.35*#6.05±2.28*3.01±1.15

2.3 研究組大鼠治療前及治療后的不同時間血清和腦脊液MBP水平及血清IL-12、IFN-γ水平比較的變化情況比較

12只大鼠予以他克莫司注射后，結果顯示，治療后的第3天及治療后第7天血清和腦脊液MBP、IL-12、IFN-γ水平均較治療前明顯降低，且腦脊液MBP水平較血清MBP水平降低更明顯，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 MS血清和腦脊液治療前及治療后的不同時間MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比較的變化情況比較（±s，n=12）

表3 MS血清和腦脊液治療前及治療后的不同時間MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比較的變化情況比較（±s，n=12）

注：與血清MBP比較，#P＜0.05

治療前 治療后第3天治療后第3天F值 P值血清MBP水平（ng/mL）（ng/mL）7.62±1.74 12.07±3.42 30.25±8.92 8.29±1.31 5.84±1.85#21.78±6.34 3.89±0.1.67±0.2 15.67±4腦脊液MBP水平IL-12（pg/mL）IFN-γ（ng/mL）15.01±4.456.65±2.19 42 3#.10 2.93±1.17 8.253 9.527 7.143 5.647＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

3 討論

MS是一種中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病，其病因及病理學機制至今仍未完全闡明，但MS自身免疫的發病機制已得到證實和公認[5]。各種原因導致髓鞘破壞后，血清或腦脊液中的MBP及血清IL-12、IFN-γ濃度增高，因此測定血清IL-12、IFN-γ及血清和腦脊液MBP的水平，可以用于反映中樞神經系統有無實質性損害及有無髓鞘脫失[6-7]。

本組研究結果顯示，研究組大鼠血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對照組（P＜0.01），提示檢測MBP含量變化是診斷MS的一項有價值的生化指標。表2結果顯示，研究組急性發作期及緩解期大鼠血清及腦脊液中MBP水平、血清 IL-12、IFN-γ 分別明顯高于對照組（P ＜ 0.01），說明大鼠活動期血清MBP明顯升高，反映了損害的范圍和嚴重程度，尤其對判斷MS是否處于活動期具有重要的臨床意義[8]；說明IL-12、IFN-γ是介導MS始發免疫反應的重要因子，可正向調節細胞免疫使病情加重，這也與有學者發現MS患者體內有高水平的循環IFN-γ的研究結論一致。

表2顯示研究組12只大鼠，其中急性發作期 8只，其腦脊液中 MBP、IL-12、IFN-γ 水平最高。 Majewska 等[9-10]研究證實，MS患者急性期腦脊液MBP與臨床評分關系密切，提出監測腦脊液MBP的變化水平，有利于判斷MS的病情嚴重程度和預后。且大鼠腦脊液MBP和血清MBP水平呈正相關（r=0.562，P＜0.01），說明作為主要自身抗原之一的MBP對MS的發病敏感性高。有學者研究顯示，IL-12在穩定期的原發進展型MS患者中顯著升高，而血清IFN-γ含量的增高對MS引起病情加重，這說明檢測患者CSF和血清中的MBP、IL-12、IFN-γ水平對于MS的診斷和療效監測有重要參考價值。

他克莫司是一種新型免疫抑制劑，是一種廣泛應用于器官移植的大環內酯類免疫抑制藥物，于1984年從日本筑波山土壤中被分離到。他克莫司除了在抑制器官移植排斥反應方面具有顯著療效外，還廣泛應用于斑禿、銀屑病、魚鱗病、糖尿病、白塞病、變應性皮炎、類風濕性關節炎以及MS等自身免疫疾病的治療，在對脊髓損傷的模型中具有保護神經，營養神經和促進神經再生和抑制T細胞增生、活化的作用。研究組12只大鼠應用他克莫司治療后，MBP水平在治療前明顯增加，但治療后的第3天及治療后的第7天的不同時間顯著下降，血清IL-12、IFN-γ水平也顯著下降。說明MS對他克莫司等激索類藥物的短程療效較好。國內外已有學者將他克莫司應用于自身免疫性疾病的研究，其中，Gold等[11]研究證實，他克莫司通過免疫抑制和神經保護作用顯著改善小鼠的髓鞘脫失和軸突損傷。

綜上所述，通過檢測周圍血和腦脊液MBP的水平，并動態觀察應用他克莫司治療前及治療后MBP、IL-12、IFN-γ的變化情況，一方面對判斷MS預后、病情嚴重程度和臨床診斷具有重要的臨床意義，另一方面可能為預防多發性硬化的臨床復發提供一種有效的新藥提供指導依據，但由于樣本量過小，仍需日后在擴大樣本量的基礎上對其進一步深入研究。

[1]O'Connor KC，Chitnis T，Griffin DE，et al.Myelin basic protein-reactive antoantibodies in the serum and cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients are characterized by low-affinity interactions[J].J Neuroimmunol，2003，136（1）：140-148.

[2]董亞賢，梁永源，林佩玉，等.MBP，TNF-α在格林-巴利綜合征與多發性硬化發病機制中的作用[J].廣東醫學，2008，29（3）：436-437.

[3]趙薛旭，田作軍，李作漢，等.多發性硬化患者腦脊液和血清中髓鞘堿蛋白和白介素-16的相關研究[J].臨床神經病學雜志，2003，16（4）：205-207.

[4]姜紅彥，王蘇平，李宏元.多發性硬化患者血清IL-17水平和髓鞘堿性蛋白相關性的研究[J].大連醫科大學學報，2011，32（2）：179-180.

[5]趙萍.腦脊液免疫學檢查對多發性硬化的診斷價值[J].醫學理論與實踐，2007，20（6）：621-622.

[6]田作軍，趙薛旭，李作漢，等.髓鞘堿性蛋白和白細胞介素16在多發性硬化發病機制和臨床中的探討[J].熱帶醫學雜志，2006，6（8）：883-884.

[7]Chamczuk AJ，Ursell M，O'Connor P，et al.A rapid ELISA-based serum assay for myelin basic protein in multiple sclerosis[J].J Immunol Methods，2002，262（1）：21-27.

[8]董亞賢，庾竹筠，林佩玉，等.髓鞘堿性蛋白和腫瘤壞死因子儀水平與Guillain-BaⅡe綜合征和多發性硬化的關系[J].中華生物醫學工程雜志，2007，13（4）：250-251.

[9]Majewska M，Zajac K，Srebro Z，et al.Epicutaneousimmunization with myelin basic protein protects from the experimentalautoimmune encephalomyelitis[J].Pharmacol Rep，2007，59（1）：74-79.

[10]田作軍，趙薛旭，李作漢，等.應用ROC曲線評價髓鞘堿性蛋白對多發性硬化的診斷價值[J].南方醫科大學學報，2009，29（2）：250-251.

[11]Gold BG，Voda J，Yu X，et al.FK506 and a nonimmunosuppressant derivative reduce axonal and myelin damage in experimental autoimmune encephalomyelitis：neuroimmunophilin ligand-mediated neuroprotection in a model of multiple sclerosis[J].J Neurosci Res，2004，77（3）：367-377.